ניתוח הפנמה נייד של חלקיקים וחיידקים על ידי Cytometry Multi-Flow דימות ספקטרלי

כדי לנתח את המנגנונים התאיים של הפנמה של ננו-חלקיקים וחיידקים באמצעות ציטומטריית זרימה עם דימוי רב-ספקטרלי. תחילה מקדימים לטיפול את המקרופאגים ב-cyto chalasin D כדי לעכב פולימריזציה של אקטין. ננו-חלקיקים או salmonella מתווספים לשכבה החד-שכבתיות של המקרופאגים ומודגרו.

לאחר מכן, המקרופאגים נאספים, מקובעים ומסומנים לצורך ניתוח באמצעות image stream. ציטומטר זרימה עם דימוי רב-ספקטרלי מבחין בין תאים שספגו ננו-חלקיקים ו/או salmonella לבין תאים שבהם ננו-חלקיקים ו/או salmonella קשורים לפני השטח. הנתונים שהתקבלו מעידים כי הן salmonella והן ננו-חלקיקים נספגים רק על ידי תאים שלא טופלו ב-cyto klain.

D המצביע על כך שההפנמה תלויה באקטין. לטכניקה זו מספר יתרונות על פני שיטות קיימות כגון ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופיה קונפוקלית. ראשית, היא מספקת מדידה מדויקת של עוצמות אות פלואורסצנטי ורזולוציה מרחבית בין מאפיינים תאיים שונים במהירות גבוהה.

שיטה זו יכולה לסייע במענה לשאלות מפתח הן במחקר על חיסוני חומרים ביולוגיים והובלת תרופות, והן בלימודי אינטראקציה בין מאח ופתוגן. הדבר כולל הגדרה של נתיבי ההפנמה המשמשים ננו-חלקיקים של פולי-אנהידריד וחיידקים. באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו מתקשים בהתחלה בביצועה.

חשוב להקדיש זמן לטיטרציה של הצבעים כדי להשיג אותות פלורסצנציה אופטימליים. כמו כן, הכרת התוכנה ויצירת תבניות ניתוח דורשות זמן. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר גילינו, באמצעות מיקרוסקופיה וטכניקות אחרות, שננו-חלקיקי poly hydro מראים מאפיינים המדמים פתוגנים.

לאחר מכן ביקשנו מערכת בעלת תפוקה גבוהה כדי להשוות את תהליכי ההפנמה המשמשים את Salmonella ואת ננו-חלקיקי הפולן הידריד לפני ביצוע הבדיקה. יש לקצור את כל תרביות התאים היונקיים והחיידקיים ולהכין את תרחיפי הננו-חלקיקים. התחילו בקצירת תאי RA W2 64.7 שהגיעו למצב של התמסכות (confluent) באמצעות גורר תאים.

קבע את מספר התאים באמצעות המוציטומטר (hemo cytometer). לאחר מכן, זרע את התאים בצלחת תרבית בעלת 24 בארות בריכוז של 5×10⁵ תאים לבאר ב-0.5 milliliters של DMEM מלא, והדגר למשך לילה ב-37 °C בתוך אינקובטור עם 5%CO2.

כדי להכין את ה-salmonella tarica, יש לדלל את ה-salmonella ב-C-D-M-E-M כדי להגיע למכפיל זיהום (MOI) של 100 לכל תאי RA W2 64.7, בתוך מבחנה מזכוכית עם פקק הברגה המיועדת לאוטוקלאב במידות 16 על 125 מילימטר. לאחר מכן, בעזרת נייר סופג סטרילי, שקלו 5 mg של ננו-חלקיקי poly anhydride טעונים ב-1% FITC, אשר יוצרו כפי שתיארו קולגות של rean בפרסומם משנת 2009 ב-Pharmaceutical Research, אל תוך מבחנה למיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר. הוסיפו את הננו-חלקיקים ל-0.5 milliliters של phosphate buffered saline קר, והניחו על קרח.

שמור את המבחנה על קרח. השתמש במעבד נוזלים אולטרסוני עם ראש מיקרו כדי לבצע סוניקציה לתמיחה למשך כ-25 שניות בעוצמה של ארבעה עד שישה ג'ול. כעת, לאחר שכל התאים והריאגנטים הדרושים מוכנים, ניתן לבצע את בדיקת הפגוציטוזה.

סמנו 24 בארות בלוחיות תרבית רקמה המכילות תאי RA W2 64.7 מתורבתים כהכנה לבדיקה בלוחית הראשונה. כל אחת מהדגימות הבאות תיבדק בשלוש חזרות: cyto and D עם ננו-חלקיקים, cyto and D עם salmonella, מצע עם ננו-חלקיקים, מצע עם salmonella, ננו-חלקיקים בלבד, salmonella בלבד, ותאים עם צבע AF six 60 בלבד. בקרות של 4 °C ייבדקו בלוחית השנייה ויכללו מצע פלוס ננו-חלקיקים ומצע פלוס salmonella. דגירה בטמפרטורה נמוכה זו מאטה תהליכים תאיים כגון פגוציטוזה. שעה אחת לפני ההשראה, הוסיפו 5 µg/mL של cyto and D ו-C-D-M-E-M לבארות המתאימות ודגרו את התאים ב-37 °C.

לאחר הדגירה, ערבלו את תגSuspend suspension של הננו-חלקיקים בעזרת vortex והוסיפו 10 µL לבארים המתאימות. לאחר מכן, ערבלו את ה-salmonella והוסיפו אותה לבארים המתאימות ב-MOI של 100. הקשו על הפלטה מספר פעמים כדי לערבב.

לאחר מכן, הניחו את פלטות הדגימות בטמפרטורה של 37 °C ואת פלטות הביקורת השלילית בטמפרטורה של 4 °C למשך 45 דקות. לאחר הדגירה, הניחו את הפלטות על קרח, ושטפו את התאים פעמיים עם PBS קר מאוד ללא סידן ומגנזיום, על ידי שאיבה והשלכה של המצע הישן כדי להסיר חלקיקים שאינם קשורים, סלמונלה ותאים מתים או מנותקים. השתמשו בפטל מגנזיום.

שטיפה מוקדמת עם PBS בשלב זה היא חיונית מכיוון שהיא מקלה על ניתוק התאים מהמצע. כדי לאסוף את התאים, הוסיפו 250 µL של PBS קר מאוד, גרדו בעדינות את הבארות, העבירו בעזרת פיפט את התאים שנאספו למבחנות מיקרו-צנטריפוגה עם מכסה נסגר (snap cap) וסיליקוניזציה, ושמרו אותן על קרח. שטפו את התאים על ידי הוספה של 1 mL של באפר שטיפה קר, ולאחר מכן ביצעו צנטריפוגה ב-250 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C. לאחר השליפת של הנוזל העליון (supernatant), הסירו את הבאפר שנותר על ידי תיפוף של מבחנת המיקרו-צנטריפוגה ההפוכה על נייר.

שחזר את משקע התאים על ידי החלקת מבחנת המיקרו-צנטריפוגה בעדינות על גבי מעמד למבחנות. כדי לקבע את התאים, הוסף 100 µL של 4% paraformaldehyde ב-PBS והמתן 15 דקות. בטמפרטורת החדר, שטוף את התאים על ידי הוספת 1 mL של perm wash buffer, ולאחר מכן סבב בצנטריפוגה ב-250 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4°C.

לאחר השלכת הנוזל העליון (supernatant), יש להסיר את שאריות הבאפר כפי שבוצע קודם לכן. לאחר מכן, צבע את תאי ה-RA W2 64.7. לצביעת actin, הוסף 100 µl של perm wash buffer המכיל Alexa Fluora foid in six 60 למשך 15 דקות.

בטמפרטורת החדר, יש להדגיר את הדגימות שאינן צבועות עם perm, בופר שטיפה ללא phin. לאחר הצביעה, יש לשטוף ולסבב את התאים בצנטריפוגה פעם נוספת, ולאחר מכן להשעותם מחדש ב-50 µL של PBS המכיל 1% PFA ולשמור אותם בחושך בטמפרטורה של 4 °C עד לרגע הרכישה. הפעל את המכשיר, את זרימת התמונות והפעל את התוכנה.

בצעו השראה ואתחול למערכת הנוזלים (fluidics) בתפריט הקבצים. בחרו בטעינת תבנית ברירת מחדל (load default template). בגלריית התמונות, תפריט תצוגה, בחרו ב"בחר הכל" ולחצו על "הפעל הגדרות" (run setup) כדי להתחיל את הדמיית החרוזים במידת הצורך; כוונו את מעקב הליבה (core tracking) כדי למרכז את התמונות באופן לטראלי.

בחר בערוץ השדה בהיר (brightfield) ולחץ על set intensity. המתן עד שמקדם השונות של מהירות הזרימה יהיה באופן עקבי נמוך מ-0.2%. בלשונית העזר (assist), לחץ על start all כדי להריץ כיליים ובדיקות, וודא שכולם עברו בתוכנה. לחץ על load sample.

לאחר מכן, כאשר תתבקשו לעשות כן, הניחו את המבחנה המכילה את הדגימה בעלת העוצמה הגבוהה ביותר. כאשר כל הפלואוכרומים נמצאים במעמיס הדגימות, בחרו בהגדלה של 40x. לאחר שנקבעו הגדרות המכשיר, אין לשנות אותן לאורך כל הניסוי.

הפעילו כל לייזר בניסוי על ידי לחיצה על אייקוני הלייזר בתוכנה, וכוון את עוצמת הלייזר כך שכל פלואורוכירום יגיע לערכי פיקסלים מקסימליים של 104,000 counts כפי שנמדד בתרשימי הפיזור (scatterplots). כדי למנוע איסוף של אובייקטים בלתי רצויים, לחצו על חלון מסווג התאים (cell classifier) בתוכנה. לאחר מכן, כדי לאסוף נתוני תאים בלבד, בחרו בערך הגבול התחתון של השטח בערוץ אחד עבור שדה בהיר (brightfield), וקבעו את הערך ל-50 micrometers; אובייקטים בעלי שטח הקטן מ-50 micrometers ייחשבו כשברים (debris) ולא ייסרקו.

בחרו את הערוצים שייאספו על ידי לחיצה על אייקוני הערוצים המתאימים בתוכנה כאן. ערוצים 1, 2, 3, 4, 5 ושש נבחרים תחת לשונית ההגדרות (setup). הזינו את מספר הקובץ ואת תיקיית היעד.

הגדירו את מספר הרצף לאחד ואת מספר האירועים לרכישה ל-5,000. לחצו על run, acquire כדי לאסוף ולשמור את קובץ הנתונים של הניסוי הראשון. לחצו על FLL והריצו את הדגימה הניסויית הבאה.

חזור על הפעולה עד שכל הדגימות הניסיוניות נאספו. לאחר מכן, כדי להריץ את הביקורות, לחץ על comp settings. פעולה זו תכבה את השדה המואר (bright field) ואת לייזר הפיזור (scatter laser) ותאפשר איסוף של כל ערוצי הפלואורסצנציה תחת לשונית acquire.

שנו את ערך הקלט ל-500. לאחר מכן הניחו את מבחנת הביקורת ולחצו על run. בצעו רכישה (Acquire) כדי לאסוף 500 תאים חיוביים בביקורות הצבועות בצבע בודד.

חזור על הפעולה עבור כל פלואורוכרום בניסוי כדי לפתח מטריצת פיצוי. לאחר שכל תמונות הדגימות נרכשו, הפעל את תוכנת הניתוח ideas במחשב ניתוח נפרד על ידי לחיצה כפולה על סמל ה-ideas בשולחן העבודה. לחץ פעמיים על אשף ההפנמה (internalization wizard) וטען את אחד מקובצי ה-RIF של דגימות הבקרה.

חלון קופץ יספק הנחיות לטעינת קבצי הבדיקה. פעל לפי ההנחיות ולחץ על כפתור ההמשך (next). לאחר מכן, לחץ על מטריצה חדשה (new matrix).

פעולה זו תפעיל את אשף הפיצוי (compensation wizard). כאשר תתבקשו, בחרו את קובצי הנתונים עבור בקרת הצבע הבודד (single color controls) כדי להוסיף אותם. לחצו על "הבא" (next) לאורך האשף בהתאם להוראות, עד שקובץ מטריצת הפיצוי יישמר וייטען לתוך התיבה בשלב השני של אשף ההפנמה (internalization wizard).

לחצו על "next" ועקבו אחר ההוראות עד שייווצר קובץ DAF. הגדירו את תכונות תצוגת התמונה על ידי בחירת ערוצי התמונה ששימשו במהלך הרכישה. לחצו על ערוץ שתיים עבור FITC ועל ערוץ חמש עבור AF 660.

בריטפילד (Brightfield) ופיזור צדי (side scatter) נבחרים כברירת מחדל. בחרו בערוץ ה-Brightfield O להגדרת גבול התא ובערוץ O2, שבו נאספו ננו-חלקיקים או חיידקים עבור הגשוש הפנימי (internalizing probe), כדי להגדיר את אוכלוסיית התאים הבודדים. לאחר מכן, ייווצר תרשים פיזור של שטח ה-brightfield לעומת יחס הגובה-רוחב (aspect ratio) של ה-brightfield עבור כל התאים. ניתוח עם תפוקה גבוהה של קובצי נתונים מרובים דורש קובץ תבנית, ולכן יש חשיבות קריטית להגדרת השערים (gates) באופן מדויק בעת יצירת קובץ התבנית.

כל נקודה מייצגת את הערכים עבור תמונה של תא בודד. לחצו על נקודה בגרף כדי לבחור את התמונה של אותו תא ספציפי בגלריית התמונות.

לאחר מכן, הגדירו שער (gate) סביב תאים בעלי שטח ויחס רבדים (aspect ratio) התואמים לאירועים של תאים בודדים. לתאים בודדים יש יחס רבדים של כ-1, בעוד שלדבאלטים יש יחס רבדים של כ-0.5.

לחצו על תאים מרובים כדי להבדיל בין האזור המכיל תאים בודדים לבין דבאלטים (doublets) או פסולת (debris). כדי להפיק היסטוגרמה של השורש הריבועי הממוצע (root mean square) של מדרג השדה המואר (brightfield gradient) בתמונת השדה המואר, לחצו על כפתור ה-next.

לאחר מכן, תחת לשונית האוכלוסייה (population), בחרו באפשרות הסלים (bin) כדי להציג את הסל שנבחר. לחצו על הסלים כדי לקבוע היכן נמצאים התאים והמיקוד המיטבי. התחילו וסמנו אזור קווי כדי לבצע גייטינג (gait) לתאים במיקוד.

ככל שערך ה-RMS של הגרדיאנט גבוה יותר, כך המיקוד טוב יותר; דלג על השלב הבא אלא אם כן ישנם צבעים נוספים שיש לבצע עבורם gating. נוצר תרשים פיזור חדש של עוצמת ערוץ שני בציר ה-x לעומת הפיקסל המקסימלי של ערוץ שני בציר ה-Y. לחץ על הנקודות וצפה בתמונות כדי לסייע בקביעת האזור שיש לסמן סביב התאים החיוביים לננו-חלקיקים או חיידקים.

היסטוגרמה של מאפיין ההפנמה (internalization) נוצרת עם אזור המתחיל באפס, אותו יש להתאים באמצעות התבוננות בתמונות. מאפיין ההפנמה הוא יחס בין העוצמה בתוך התא לעוצמה של התא כולו. הוא מכויל כך שבערך של אפס, מחצית מהעוצמה נמצאת בפנים.

האשף יצר עבור כל תא אזור המגדיר את פניו של התא על ידי יצירת מסכה, המשמשת כקלט לתמונת התא כדי למצוא את פני השטח של התא, ושחוקה בארבעה פיקסלים. שימו לב שניתן להתאים מסכה זו ידנית עבור סוגי תאים שונים בעת הצורך, על ידי יצירת מסכת אובייקט על גבי תמונת השדה הבהיר (brightfield) תחילה ושחיקתה במספר רב או מועט יותר של פיקסלים. תכונת ההפנמה (internalization) מחושבת על בסיס מסכת אובייקט שחוקה זו באמצעות אלגוריתם בתוכנה.

תכונה זו מאפשרת לנו להבדיל בין חלקיקים וחיידקים שהופנמו, שרוב האות הפלואורסצנטי שלהם נמצא בתוך גבול המסכה, לבין חלקיקים וחיידקים הקשורים לפני השטח, שרוב האות הפלואורסצנטי שלהם נמצא מחוץ לגבול המסכה כפי שמוצג בדוגמה זו; צור היסטוגרמה חדשה עם תכונת הפנמה חדשה המבוססת על מסכת האובייקט שנשחקה (eroded object mask). שרטט אזור כדי לבצע סינון (gate) של תאים שהופנמו על ידי צפייה בדימויים במצב סל (bin mode) נבחר. הגדר את הסינון ב-0.3 כאן.

תאים עם ציון נמוך מ-0.3 נחשבים לתאים חיוביים לחלקיקים הקשוריים לפני השטח. כדי להסיר תאים עם סימון רקע ולזהות ננו-חלקיקים או חיידקים שהפנימו באופן ספציפי, בחרו מאפיינים מתוך תפריט הניתוח (analysis menu). לחצו על תפריט הניתוח.

לאחר מכן, לחצו על תכונת ספירת הנקודות (spot count) כדי להוסיף את ממוצע ספירת הנקודות לדוח הסטטיסטיקה. בתפריט הדוחות, לחצו על סמל הדוחות. לאחר מכן, הגדירו דוח סטטיסטיקה, הוסיפו עמודות ובחרו באוכלוסיית התאים המתאימה.

לחצו על אישור. אשף הפנימיזציה יוסיף אוטומטית סטטיסטיקה לדוח זה כדי לשמור את קובץ הנתונים כקובץ תבנית שישמש לניתוח אצווה של כל הקבצים הניסויים. לחצו על תפריט הקובץ ובחרו ב"שמור כתבנית".

קבצי תבנית. בעלי סיומת .AST לניתוח מספר קבצי נתונים בתוכנת idea. לחצו על tools ובחרו batch data files והזינו את כל קבצי ה-RIF.

הוסיפו את קובץ מטריצת הפיצוי ואת קובץ התבנית בסעיפים המתאימים כדי להגיש את העבודה לעיבוד, ולאחר מכן לחצו על submit. לאחר שלב העיבוד, כל קובצי ה-RAF מנותחים ונוצרים קובצי DAF עבור כל אחד מקובצי הגלם הבודדים. דוח סופי מופק עם סטטיסטיקות עבור כל הדגימות כדי להשוות את השפעת עיכוב האקטין וטמפרטורה נמוכה על הפגוציטוזה של salmonella וננו-חלקיקים.

תאי RA W2 64.7 דגרו בטמפרטורה של 37 degrees Celsius במצע, עם או ללא cyto chalasin D, או דגרו במצע בטמפרטורה של four degrees celsius. הן הטמפרטורה והן המניפולציות על האקטין הפחיתו את ההפנמה של הננו-חלקיקים ושל הסלמונלה. עם זאת, דגירת התאיים עם cyto chalasin D העלתה את אחוז התאים עם ננו-חלקיקים קשורים לפני השטח, בעוד שהיא הפחיתה את אחוז התאים עם סלמונלה קשורה לפני השטח.

אחוז התאים החיוביים לננו-חלקיקים הקשורים לפני השטח עלה מכ-8% ב-37 °C ליותר מ-35% לאחר טיפול ב-cytochalasin D או ב-4 °C. לעומת זאת, אחוז התאים עם salmonella הקשורה לפני השטח פחת מ-35% ל-15% בעקף טיפול ב-cytochalasin D. דגירה של תאי RAW 264.7 עם salmonella ב-4 °C הפחיתה את ההפנמה ללא עלייה ניכרת בכמות החיידקים הקשורים לפני השטח בהשוואה לביקורת ב-37 °C. יחד, נתונים אלו מוכיחים כי salmonella וננו-חלקיקים מפנימים על ידי תהליך תאי דומה, התלוי בטמפרטורה ודורש אקטין.

יתרה מכך, הנתונים מעידים כי היצמדות ממושכת של salmonella למקרופאגים דורשת פולימריזציה של אקטין. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבחון הפנמה תאית של ננו-חלקיקים וחיידקים באמצעות ציטומטריה של זרימת תמונות רב-ספקטרלית. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור שמעכבים הם ציטוטוקסיים.

לפיכך, יש לבצע ניסויי פרופיל ציטוטוקסיות מוקדמים כדי לקבוע את הריכוזים האופטימליים לשימוש. זכרו כי עבודה עם salmonella עלולה להיות מסוכנת; יש להקפיד על אמצעי זהירות, כגון לבישת ציוד הגנה אישי מתאים ומניעת יצירת אירוסולים, בעת ביצוע פרוצדורה זו.