מעקב אחר שינויים בריכוז הסידן התאיים ויעילות הסינפטית ברכיכות

סידן תוך-תאי נחשב לחלק חשוב ממספר מנגנונים של פלסטיות סינפטית. ניתן לבחון רעיונות אלו על ידי ניטור סימולטני של שינויים ברמות הסידן ושינויים ביעילות הסינפטית. כאן אנו מדגימים כיצד ניתן להשיג זאת על ידי שילוב של דימות סידן יחד עם רישום תוך-תאי.

הניסויים שלנו נערכים עם גנגליון של רכיבל מסוג Aplysia Cahora. להכנה זו מספר יתרונות, כגון נוירונים מזוהים גדולים, טמפרטורות נמוכות הטבעיות ל-apia, ואותות איטיים המקלים על הדימות, אך הטכניקות הכלליות שאנו מדגימים ניתנות להעברה בקלות למערכות אחרים. שלום, אני קולין אוונס מהמעבדה של אליזבת קרופר במחלקה למדעי העצבים פישבורג ובמכון פרידמן למוח בבית הספר לרפואה מאונט סיני בניו יורק.

היום נדגים הדמיה סימולטנית של שינויים בריכוז הסידן התוך-תאי ובביעילות סינפטית בגנגליון הפה (buccal ganglion) של הרכיכה Aplysia cahora. כדי לזהות סידן תוך-תאי, נזריק לנוירון פרה-סינפטי את צבע האינדיקטור לסידן calcium orange, החודר דרך ממברנת התא. לאחר מכן, הדגימה תועבר אל מתחת למיקרוסקופ, ונוירונים פרה- ופוסט-סינפטיים יינעצו באמצעות אלקטרודות חדות.

גירוי פרה-סינפטי חוזר גורם לתגובה פוסט-סינפטית מוגברת, הנראית כעלייה בפוטנציאל הפוסט-סינפטי או באמפליטודה של ה-PSP. מדידת האות הפלואורסצנטי של צבע המחוון לסידן תאפשר לנו לזהות שינויים סימולטניים בריכוז הסידן התוך-תאי בטרמינל הפרה-סינפטי. לתחילת הפעולה, הרדימו בעל חיים בוגר השוקל כ-150 גרם על ידי הזרקה של 75 mils של תמיסת מגנזיום כלוריד איזוטונית, הצמידו את בעל החיים המורדם לצלחת מצופה בשעווה, ולאחר מכן, באמצעות פינצטה ומספריים, בצעו חתך בכף הרגל של בעל החיים וחשפו את ה-buccal mass.

הגנגליון הפהי (buccal ganglion) נמצא בצדו הגבון של מסת הפה ומורכב משני חצאי גנגליונים מחוברים. הוא מכיל כמה מאות נוירונים שביחד עם נוירונים בגנגליונים אחרים תורמים ליצירה ולבקרה של התנהגות ההאכלה של בעל החיים. שחררו בזהירות את הגנגליון על ידי חיתוך כל העצבים הפהיים עם מספריים עדינים והוציאו אותו מהבעל החיים.

לאחר מכן, הצמיד את הגנגליון המשוחרר לבסיס של צלחת מצופה ב-sil guard ומלאה במי ים מלאכותיים. הגנגליון עטוף בנדן של רקמה חיבורית, שיש להסירה כדי לחשוף את הנוירונים הבודדים. השתמש בפינצטה עדינה, במספרי איריס ובזהירות רבה כדי לחתוך ולהסיר נדן זה.

כדי למנוע פגיעה בנוירונים, ייסבו את הגנגליון לאחר הסרת המעטפת בעזרת סיכות למשך כ-15 דקות, שכן כל תזוזה תהיה בעייתית במהלך הדימוי. כדי להכין אלקטרודות חדות להקלטה תוך-תאית ולהזרקת צבע, משכו צינוריות קפילריות באמצעות מושך מיקרו-אלקטרודות. אנו משתמשים בזכוכית בורוסיליקט בעלת דפנות דקות עם קוטר חיצוני של 1 מילימטר.

לאלקטרודות ההקלטה צריכה להיות התנגדות של כ-10 mega כאשר הן מלאות באסטט פוטסיום בריכוז של three molar, ולכן אנו מכוונים את השובך (puller) בהתאם כדי למלא את אלקטרודות ה-D. טבלו את החלק האחורי של האלקטרודה שנשבכה לתוך תמיסה של צבע calcium orange בריכוז 10 millimolar; פעולת נימיות לאורך סיב הזכוכית בתוך האלקטרודה תמשוך את הצבע אל הקצה, ולאחר מכן מלאו שוב את האלקטרודה ב-potassium chloride בריכוז 200 millimolar כדי להבטיח מגע חשמלי טוב. אנו משתמשים ב-Bela שנבנה בהתאמה אישית כדי לשפר את תכונות האלקטרודה ולהנמיך את התנגדות אלקטרודת ההקלטה לכ-five mega.

האלקטרודה מוחזקת בזווית של 45 מעלות בתוך זרם של תמיסת אלומינה (aluminum oxide). ערבוב של sodium chloride לתוך התמיסה וחיבור של מד עכבה (ohmmeter) מאפשרים ניטור של התנגדות האלקטרודה. במהלך תהליך השיוף (beveling), אנו מעבירים את הצלחת המכילה את ganglion-ים של ה-buckle המבודדים למערך אלקטרופיזיולוגי ומאתרים את הנוירונים הרלוונטיים על ידי דקירה שלהם באלקטרודות ואימות זהותם.

כדי להכין נוירון לדימות סידן, אנו מחדירים תחילה אלקטרודה ממולאת בצבע אל גוף התא (soma) וטוענים את הצבע באופן אלקטרופורטי באמצעות פולסי זרם של 15 nano amp בהיפר-פולריזציה למשך 30 דקות. עם כניסת ה-D calcium orange לתא, ה-SOR יקבל גוון ורוד חלש. לאחר מכן, אנו מושכים בזהירות את אלקטרודות ההקלטה ומשאירים את הדגימה למשך 30 דקות לפחות כדי לאפשר לצבע להתפשט אל תוך התהליכים העדינים של הנוירון.

בשלב הבא, העבירו את הצלחת עם הדגימה למיקרוסקופ פלואורסצנטי. אנו משתמשים בעדשת טבילה במים עם הגדלה של 10 פעמים ו-NA 0.3 במיקרוסקופ עם שולחן קיבוע אנכי, הממקד את התמונה על ידי הזזת העדשה ולא את השולחן. דבר זה מקל על התקנת המניפולטורים.

עבור אלקטרודות ההקלטה, בחרו בלוק סינון מתאים. בלוק סינון SI three יספק את מסנני העירור והפליטה הנכונים עבור calcium orange; כווןו את פרמטרי המצלמה ואת עוצמת התאורה באמצעות מסנני צפיפות ניטרלית ומפתח השדה. תאורה חזקה יותר תביא לרעש נמוך יותר, אך עלולה לגרום להלבנה (bleaching) של הדגימה.

מצלמת ה-CCD מסוג cool snap יכולה ללכוד שדה של 500 על 300 פיקסלים בקצב פריימים של כ-30 פריימים לשנייה, וביחס אות לרעש טוב. יש לצמצם את התאורה של נוירוני ה-fil על ידי השארת תריס מקורות האור סגור ככל הניתן. בתוכנת הדימות, בחרו אזורי עניין (regions of interest) או RoIs.

אזורים אלה מגדירים היכן התוכנה תבצע מדידות עוצמה. בדרך כלל אנו מדמיינים ענפים ראשוניים, שניוניים ושלישוניים של הנוירון הפרה-סינפטי. מקמו ROI נוסף לצד הנוירון ה-difi כדי לקבל ערך רקע שיסורק מאוחר יותר מכל שאר נקודות הנתונים.

אלקטרודות להקלטה תוך-תאית בנוירונים פרה-סינפטיים ופוסט-סינפטיים משמשות להשראה ולניטור של תמסורת סינפטית. ניתן להבטיח סנכרון בין רכישת נתונים אלקטרופיזיולוגיים לבין רכישת נתוני דימוי אם משתמשים באות הטריגר (frame out trigger) של המצלמה כדי להפעיל את התוכנה לרכישת נתונים. דרך נוספת להבטחת סנכרון היא התקנת LED בתוך פתח המצלמה.

נורת LED זו נדלקת לזמן קצר בתחילת סשן ההקלטה, ובכך מספקת סימן לסנכרון. במהלך ניסוי טיפוסי, מעוררים פוטנציאלי פעולה בנוירון הפרה-סינפטי על ידי הזרקה של פולסי זרם קצרים. בדוגמה זו, אנו מראים פרץ של ספייקים (spikes) ועליות תואמות באות הסידן כדי לבחון היפותזות ספציפיות.

ניתן להשפיע על אות הסידן ולקבוע את השפעותיו על ההעברה הסינפטית. לדוגמה, ניתן להזריק באופן פרה-סינפטי או להחדיר באמצעות מערכת הפרופוזיה תרופות כגון הצ'לטור של סידן EGTA. הנתונים מנותחים על ידי ייצואם מתוכנת הדימוג לקובץ טקסט ולאחר מכן לתוכנה ששימשה לרכישת הנתונים האלקטרופיזיולוגיים, שבמקרה שלנו היא spike two של Cambridge Electronic Design.

אנו משתמשים בסקריפט שנכתב בהתאמה אישית כדי להוציא גרף של ערכי העוצמה של ה-ROI והשינויים התואמים בפוטנציאל הממברנה, ולכמת שינויים באות הסידן על ידי חיסור אות הרקע שהתקבל מ-ROI הרקע וחישוב השינוי היחסי באמצעות המשוואה המוצגת. F zero הוא הפלואורסצנציה רגע לפני הגירוי, ו-F הוא הפלואורסצנציה במהלך הגירוי. כאן אנו מציגים תוצאות של ניסוי שבו דימנו שינויים בפלואורסצנציית סידן בנוירון B 21 שזוהה.

האזור שצילמנו מסומן ב-A; ב-B 1, השרנו פרץ של פוטנציאלי פעולה (spikes) ב-B 21, אשר גרמו לפוטנציאלים פוסט-סינפטיים ב-B 8 ולשינוי באות הסידן. B 2 מראה את ההשפעה של הזרקת קלטור הסידן EGTA; פוטנציאלי פעולה ב-B 21 אינם גורמים עוד לעליות נרחבות בפלואורסצנציית הסידן, ואמפליטודת הפוטנציאל הפוסט-סינפטי פחתה.

לסיכום, הדגמנו טכניקות שניתן להשתמש בהן כדי לנטר בו-זמנית את ריכוז הסידן התוך-תאי ולהעריך את יעילות התמסורת הסינפטית. טכניקות אלו דורשות ציוד צנוע בלבד בהשוואה לרוב שיטות הדימות התפקודי, והן קלות ומהירות ללמידה.