ניצול מתודולוגיות משולב להגדיר את התפקיד של משלוח ממברנה פלזמה במהלך אקסון מסעף ו העצבית המורפוגנזה
16 במרץ 2016
טכניקות מיקרוסקופ אור בשילוב עם מבחנים ביוכימיים מבהירים את המעורבות של אקסוציטוזיס בתיווך SNARE בהסתעפות אקסונים תלויי נטרין. שילוב טכניקות זה מאפשר זיהוי של מנגנונים מולקולריים השולטים בהסתעפות האקסון ובשינוי צורת התא.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע תצפיות ניתנות לכימות של ההתרחשות הזמנית והמרחבית של פושיון שלפוחית אקסוציטית עצבית והסתעפות אקסון. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון מתי והיכן איחוי שלפוחית מחדיר חומר ממברנה לקרום הפלזמה המתרחב במהלך התפתחות העצבים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משלבת הדמיית תאים חיים כדי לרכוש רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה בתאים בודדים וגישות ביוכימיות לרכישת מידע מבוסס אוכלוסייה.
לאחר תרבית והדמיה של נוירונים בקליפת המוח עם Netrin-1 או בקרה על פי טקסט הפרוטוקול. שאפו PBS מהבאר הראשונה של מצב והחליפו ב-250 מיקרוליטר של מאגר הומוגניזציה. דגירה על קרח במשך חמש דקות, ולאחר מכן באמצעות מרים תאים, הומוגניזציה של התאים על הקרח.
שאפו את ה-PBS מהבאר הבאה באותו מצב והוסיפו לבאר את התערובת ההומוגנית לאחרונה שתגדיל את ריכוזי החלבון. לאחר מכן, העבירו את התמיסה ההומוגנית לצינור מיקרופוגה מקורר מראש של 1.6 מיליליטר על קרח, והוסיפו 20% טריטון X-100 כדי להגיע לריכוז סופי של 1%ואז עם פיפטה של 1,000 מיקרוליטר, טריטו את התערובת עשר פעמים תוך מזעור בועות. דגרו את הצינורות על קרח למשך שתי דקות כדי להמיס את החלבונים.
לאחר מכן צנטריפוגה ב-6, 010 RCF ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לגלול את החומר הלא מסיס. העבירו את חומר העל לתוך צינור צונן חדש של 1.6 מיליליטר על קרח. לאחר מכן, השתמש במבחן ברדפורד כדי לקבוע את ריכוז החלבון.
לאחר מכן, השתמש במאגר הומוגניזציה עם 1% Triton X-100 ומאגר דגימה 5X בתוספת BME כדי לדלל את הדגימות לריכוז סופי של 3-5 מיליגרם למיליליטר. חלקו כל דגימת ניסוי באופן שווה לשני צינורות. לאחר מכן דגרו דגימה אחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, והשנייה ב-100 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
הפוך את הצינורות לסירוגין כדי לשמור דגימות בתמיסה. לאחר מכן בצע את דף SDS ואת הכתמים המערביים על פי פרוטוקול הטקסט. לאחר הגדרת מיקרוסקופ ה-TIRF והדגימה ומציאת מישור מוקד עצבי על פי פרוטוקול הטקסט.
הפעל את תוכנת הלייזר והתחבר לתוכנת בקרת הלייזר. הגדר את התאורה לשדה רחב ובחר את המטרה. לאחר מכן הגדר את מקדם השבירה של הדגימה והתאם את עוצמת הלייזר על ידי ביטול הסימון של TTL עבור לייזר 491.
אופטימיזציה של פרמטרי הדמיה חשובה במהלך הדמיה של שלפוחיות אקסוציטיות שלמות ברצפה כדי למנוע סחיפה של מיקוד ופוטוטוקסיות תוך הפקת תמונות של יחס אות לרעש גבוה המספיק לניתוח. התאם את המחוון ל- 100 ולאחר מכן הורד אותו בחזרה לערך שבין 20 ל- 40. לאחר מכן בדוק שוב את TTL.
לאחר מכן, התמקדו שוב בדגימה בתאורת אור משודרת. לאחר מכן, בתוכנת ההדמיה, בחר את תאורת הלייזר 491 ופתח את התריס. הנח את המעבה הפוך על הספסל האופטי כדי לא לשרוט את העדשה.
כוונן בסדר את נקודת המוקד של הלייזר על התקרה וכאשר הקבל הוסר, מרכז את הנקודה למרכז דיאפרגמת השדה הסגור. לאחר מכן החלף את המעבה ובתוכנת TIRF שלח את עומק החדירה ל -110 ננומטר. לאחר מכן עבור מתאורת שדה רחב למצב תאורת TIRF להדמיה.
כעת, באמצעות אפיפלואורסצנציה בשדה רחב מצא תאים המבטאים פלואורנט VAMP2 דרך העיניים. לאחר מכן, כדי להפחית את ההלבנה והפוטוטוקסיות, התאם את פרמטרי ההדמיה כדי למקסם את יחס האות לרעש ואת הטווח הדינמי באמצעות זמן חשיפה מינימלי ועוצמת לייזר. הגדר מיקוד אוטומטי רציף לכל תא.
לאחר מכן רכוש סט תמונות זמן-lapse עם רכישה המתרחשת כל 0.5 שניות למשך חמש דקות. למצב המעורר Netrin-1 במכסה זרימה למינרית, יש להוסיף לריכוז סופי של 500 ננוגרם למיליליטר של Netrin-1 לצלחת תאים ולהחזיר את המנה לאינקובטור למשך שעה לפני ההדמיה. לכמת את תדירות האירועים האקסוציטיים המנורמלים לפי שטח תא וזמן.
ב- ImageJ, פתח אוספי תמונות על-ידי גרירת הקובץ לחלון או על-ידי בחירה באפשרות File, Open, file name. להסרת אותות פלואורסצנטיים יציבים שאינם מייצגים אירועי היתוך שלפוחית, השתמש ב-Image, Stack, Z Project, Projection type Average Intensity. כדי ליצור הקרנת Z ממוצעת של כל הערימה.
הפחיתו את התמונה הממוצעת המתקבלת מכל תמונה בהילוך מהיר באמצעות תהליך, מחשבון תמונה, תמונה 1 הערימה שלך, פעולה הפחת תמונה שתיים. התוצאה היא הקרנת Z חדשה שנוצרה. זה ידגיש אירועים אקזוציטיים.
כעת בעין, ספור אירועי פושיון אקסוציטיים, שניתן לזהות ככתמים של אותות פלואורסצנטיים מוגבלים עקיפה המתפזרים במהירות כאשר VAMP2 פלואורן מתפזר בתוך קרום הפלזמה. סמן את התמונה הראשונה באמצעות תמונה, התאמה, סף והתאם את המחוון עד שהתא כולו יסומן בסף. לאחר מכן, תחת ניתוח, בחר הגדר מידות ובדוק את האזור ואת תווית התצוגה.
בעזרת כלי מעקב השרביט, הגדר את האזור הסלולרי הסף ולחץ על M כדי למדוד. העבר את הנתונים שנאספו לגיליון אלקטרוני בהתאם לפרוטוקול הטקסט. לאחר יומיים במבחנה, הנח את צלחת ההדמיה בתחתית הזכוכית המכילה נוירונים לא מועברים בתא סביבתי לח שחומם מראש.
השתמש במיקרוסקופ המצויד בעדשת אובייקטיבית אפוכרומט 1.4 NA DIC בתוכנית DX ומעבה צמצם מספרי גבוה לאיכות התמונה והרזולוציה הטובות ביותר. לאחר מכן, עם תאורת אור מועברת, התאם את מישור המוקד כדי למצוא נוירונים דרך עיניים. עבור הדמיית DIC של הסתעפות אקסונים, הגדרה נכונה של תאורה קרירה יותר תהיה חלק בלתי נפרד מאופטימיזציה של התמונה והיא קריטית להפקת תוצאות ניתנות לניתוח.
לאחר מכן, כאשר הנוירונים המעניינים נמצאים בשדה הראייה, השתמשו בפונקציית הרכישה הרב-אזורית בתוכנת ההדמיה כדי למצוא ולשמור את מיקומי ה-XYZ של לפחות שישה תאים. כעת, הוסף לריכוז סופי של 250 ננוגרם למיליליטר של Netrin-1 או גורם מעניין אחר כדי לדמות את התאים ולחץ על התחל רכישה מרובת אזורים. רכוש תמונות ברצף בכל מיקום כל 20 שניות למשך 24 שעות.
השהיית הרכישה ומיקוד מחדש לפי הצורך. בתוך תוכנת ההדמיה, סקור תמונות על-ידי בחירה באפליקציות, סקור נתונים רב-ממדיים ופתח את הקובץ הרצוי. זהה ענפי אקסון יציבים שנוצרו במהלך הפעלת ההדמיה.
השתמשו בכלי אזור העקיבה למדידת ענף אקסון יציב מבסיס האקסון ועד לקצה. לאחר טיפול בתאי עצב עם רעלן נטרין ובוטולינום וקיבוע וצביעה חיסונית, וצביעה חיסונית לבטא-3 טובולין ואקטין לפי פרוטוקול הטקסט. השתמש במיקרוסקופ הפוך כדי לאסוף תמונות אפיפלואורסצנטיות בשדה רחב.
פתח ערימת תמונות ב-ImageJ וכדי לנתח ידנית את קו ההסתעפות, השתמש בקו, קו מפולח ועקוב אחר האקסון המוגדר כנויריט הארוך ביותר המשתרע מהסומה. עם ניתוח, כלים, מנהל החזר ROI, שמור את מעקב האקסונים כאזור עניין. לאחר מכן עקבו ושמרו כל ענף אקסון, המוגדר כנויריט גדול או שווה באורך של 20 מיקרומטר.
כלול רק ענפים ראשוניים בניתוח. מוצג כאן כתם מערבי לאחר השלמת בדיקת קומפלקס SNARE עמיד ל-SDS. נבדק עבור SNAP25, Syntaxin 1A ו-VAMP2.
חלבוני SNARE בקומפלקס, מונומרים הניתנים לזיהוי מוצגים כאן. דוגמה לאירוע אקסוציטי בתיווך VAMP2 fluroen המתרחש לאורך זמן בנוירון קליפת המוח מוצגת כאן. השיבוצים המוגדלים מציינים את הסומה, ענף אקסון וחרוט גידול אקסונלי המראים את התועלת המרחבית של בדיקה זו.
מעגלים מפוצצים אירועי היתוך אקסוציטי בודדים, אותם ניתן לראות באמצעות מיקרוסקופ TIRF. הדמיית DIC זו של זמן-lapse מראה את היווצרות ענף אקסון מגורה של Netrin בזמן אמת. מיקומים אלה מציינים את הבליטה הראשונית מאתר סניף.
אלה מייצגים ענפים יציבים שנוצרו במלואם של לפחות 20 מיקרומטר שנמדדו מהאקסון הראשי לקצה הענף. בניסוי זה, נוירונים בקליפת המוח ב-3 DIV טופלו ב-Netrin-1, הממריץ הסתעפות או רעלן בוטולינום A, המבקע את SNAP25, מרכיב של קומפלקס SNARE וחוסם אקסוציטוזיס. התוצאות מדגימות כי אקסוציטוזיס בתיווך SNARE נדרש להסתעפות תלויה ב-Netrin.
לאחר השליטה, ניתן להשלים את הדמיית ה-DIC בפגישת הדמיה אחת של לילה. ניתן לנהל הדמיית TIRF של אירועים אקסוציטיים בודדים תוך 4-5 שעות. ניתן לבצע את פרוטוקול הביוכימיה של היווצרות מורכבת SNARE תוך שעתיים.
בזמן שאתה מנסה את ההליכים הללו, חשוב לזכור להגביר את הקצב ולא למהר אף צעד. כל הליך דורש תשומת לב וסבלנות לקבלת התוצאות הטובות ביותר. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו העברה משותפת של רכיבי שלפוחית מתויגים עם מטענים מועמדים מתויגים כדי לענות על שאלות נוספות.
כמו מהו המטען של השלפוחיות האקזוציטיות? לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח לחקור נויריטוגנזה, הסתעפות אקסונים ושלבים אחרים במורפוגנזיס בכל תרבית עצבית מנותקת. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להתבונן ולכמת את האופי המרחבי והטמפורלי של אירועי היתוך שלפוחית אקסוציטית עצבית המתאימים לשינויים במורפוגנזיס העצבי
.אל תשכח שעבודה עם רעלן בוטולינום או לייזרים בעלי עוצמה גבוהה עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון לבישת בגדי בטיחות מתאימים ושימוש במנגנון נעילת הבטיחות של המיקרוסקופ בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה עושה שימוש בטכניקות מיקרוסקופיה של אור ובבדיקות ביוכימיות כדי לחקור אקסוציטוזה המתווכת על ידי SNARE בהסתעפות אקסונים תלויה ב-netrin. השילוב של שיטות אלו מאפשר זיהוי של מנגנונים מולקולריים המווסתים את הסתעפות האקסונים ושינויים במבנה התא.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- הבנת הת branching של האקסון חיונית להתפתחות נוירונלית.
- חלבונים ממשפחת SNARE ממלאים תפקיד משמעותי בהיתוך של שלפוחיות במהלך אקסוציטוזה.
- Netrin-1 הוא גורם מפתח המשפיע על הנחיית האקסון והת branching שלו.
- דימיון של תאים חיים מספק תובנות לגבי תהליכים תאיים דינמיים.
מטרת המחקר
- להשקיף על התזמון והמיקום של היתוך של שלפוחיות אקסוציטיות נוירונליות.
- לקבוע כיצד היתוך שלפוחיות תורם להסתעפות אקסונים.
- לשלב דימות חי עם בדיקות ביוכימיות לצורך ניתוח מקיף.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דימוי תאים חיים לרזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה.
- בדיקות ביוכימיות לאיסוף נתונים ברמת האוכלוסייה.
- תרבית וגירוי של נוירונים קורטיקליים באמצעות Netrin-1.
- הומוגניזציה של תאים לצורך ניתוח נוסף.
תוצאות עיקריות
- זיהוי תפקידה של אקסוציטוזה המתווכת על ידי SNARE בהסתעפות אקסונים.
- הדגמה של הדינמיקה המרחבית והזמנית של היתוך שלפוחיות.
- תובנות לגבי האופן שבו חומר ממברנה משולב במהלך התפתחות עצבית.
- ביסוס שיטה לתצפיות כמותיות במדעי המוח.
מסקנות
- המחקר מעמיק את ההבנה של מנגנוני התבססות האקסונים.
- שילוב של טכניקות דימוי וטכניקות ביוכימיות הוא יעיל למחקר במדעי העצב.
- הממצאים עשויים להנחות מחקרים עתידיים על התפתחות ותפקוד נוירונלי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הבנת הרגולציה הספרטיו-טמפורלית של הובלת ממברנת הפלזמה במהלך התבסעות אקסונית מספקת תובנות מכניסטיות לגבי מורפוגנזה נוירונלית הרלוונטית למידול הפרעות התפתחותיות של מערכת העצבים. מתודולוגיה משולבת זו מאפשרת הפחתת סיכונים באימות מטרות על ידי קישור אקסוציטוזה המתווכת על ידי SNARE לפלסטיות מבנית ברשתות נוירונליות. גישה זו תומכת בביטחון חיזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי כימות דינמיקת היתוך של שלפוחיות כקריאה תפקודית של איתות רמזי הדרכה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן את תפקידה של השכיחתו של קומפלקס SNARE בענפה של אקסונים התלויה ב-netrin-1, במטרה לתקף את היתוך הוזיקולות כצומת מכניסטית בתהליך הנווריטיגנזה.
- ערך תפעולי: מאפשר קורלציה בין אירועי אקסוציטוזה של וזיקולות בודדות לבין ביוכימיה של SNARE ברמת האוכלוסייה, לצורך הערכת מעורבות המטרה ברב-קנה מידה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: ביסוס מיקרוסקופיית TIRF של VAMP2-pHluorin כבדיקה כמותית לתדירות אקסוציטוזה המגורה על ידי netrin-1, מנורמלת לשטח התא ולזמן.
- ערך תפעולי: אספקת פרוטוקול דימוי סטנדרטי לזיהוי שינויים בקינטיקת איחוי של שלפוחיות בעקבות הפרעה פרמקולוגית או גנטית של מנגנון ה-SNARE.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מדגים כי פירוק של SNARE המתווך על ידי רעל בוטולינום חוסם התפצלות אקסונים התלויה ב-netrin-1, ובכך מבסס את האקסוציטוזה כשלב הכרחי בפלסטיקה מורפולוגית.
- ערך תפעולי: תומך בשימוש בדימות time-lapse ב-DIC לכימות של היווצרות ענפי אקסון יציבים לאורך 24 שעות כמדד פנוטיפי למודולציה של מסלולים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטה זו מגשרת בין בדיקות דימוי לשלב הגילוי המוקדם לבין תיקוף ביוכימי, במטרה לתמוך בבדיקת השערות לגבי מטרות במסלולי התפתחות עצבית.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות לגבי סיגנל של רמזי הכוונה (guidance cue) באמצעות תצפית ישירה על אירועי היתוך של שלפוחיות בתגובה לגירוי של netrin-1.
- סריקה: מספקת פלטים כמותיים המוכנים לבדיקה של תדירות אירועי אקסוציטוזה ומדדי הסתעפות של אקסונים עבור קמפיינים של סריקת תרכובות או סריקה גנטית.
- אנליטיקה: מייצרת קריאות מדידות הכוללות רמות של קומפלקס SNARE באמצעות Western blot, ספירת אירועי אקסוציטוזה באמצעות TIRF, ואורך הסתעפות באמצעות דימיון DIC לקבלת החלטות מבוססות נתונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין מנגנון מולקולרי (אקסוציטוזה תלוית-SNARE) לבין פנוטיפ תאי (הסתעפות אקסונים), ובכך מאפשרת רציפות פרה-קלינית במודלים של צמיחת נוריטים.
- שימוש חוזר ארגוני: משלבת דימיון חי ובדיקות ביוכימיות לכדי פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר ללימוד דינמיקת ממברנות במודלים של דיפרנציאציה והתחדשות עצבית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק הפחתת סיכונים מכניסטית על ידי ביסוס האקסוציטוזה המתווכת על ידי SNARE כתהליך הנדרש עבור התבססות ענפים אקסוניים המונח על ידי netrin-1.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של תהליכי עבודה של דימיוןB קורלטיבי וביוכימיה לשיפור השחזוריות במעבדות החוקרות מורפוגנזה נוירונלית.
- ערך אסטרטגי: מפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות על ידי קישור הפרעות מולקולריות (למשל, פיצול SNARE) לתוצאות מבניות ברשתות נוירונליות.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תעדוף מטרות מותאם סיכון המעורבות בתעבורת שלפוחיות ובקישוריות אקסונית, בהתבסס על תיקוף פנוטיפי תפקודי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות נוירונים, מיקרוסקופיית TIRF של תאים חיים וביוכימיה של SNARE.
- תלוי בגישה לתאי דימוי מיקרופלואידיים, מערכות TIRF מבוססות לייזר ותשתית ל-Western blotting.
- מחייב סטנדרטיזציה של תזמון גרייה ב-netrin-1 ושל פרוטוקולי טיפול ברעלים בין הקבוצות הניסיוניות.
- כולל שיקולי התאמה ליישום הבדיקה בסוגי נוירונים שונים או במודלים הרלוונטיים למחלות.
- מוגבל בשל המורכבות הטכנית של קישור אירועים של וסיקולות בודדות לבדיקות ביוכימיות של אוכלוסיות ללא צינורות עיבוד אוטומטיים לניתוח תמונות.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:48
SNARE Complex Formation Assay
3:12
Imaging Exocytic Events via TIRF Microscopy
8:08
Differential Interference Contrast Timelapse Microscopy of Axon Branching
10:10
Toxin Manipulations and Fixed Cell Immunofluorescence
11:13
Results: SNARE-mediated Exocytosis in Netrin-dependent Axon Branching
12:58
Conclusion
