ניתוח אופטימיזציה של מתילציה דנ"א ביטוי גנים מ, אזורים קטנים אנטומית מוגדרים של המוח

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לחקור שינויים במתילציה של DNA וביטוי גנים בעקבות סטרס בשלב מוקדם של החיים. דבר זה מושג תחילה על ידי חשיפת גורי עכבר רכים להפרדה מאמם כדי להשרות סטרס בשלב מוקדם של החיים, ובשלב שני מופקים אזורי מוח רלוונטיים, במקרה זה ה-PVN, באמצעות מיקרו-דיסקציה in loco, ו-DNA ו-RNA מבודדים בו-זמנית מדגימה בודדת של רקמה (tissue punch).

בשלב הבא, ה-DNA שהתקבל עובר טיפול בסולפיט, והאזור המדובר מועשר באמצעות bi sulfite PCR. לאחר מכן, המקטע מקושר לתוך וקטור ומועבר לתוך חיידקים באמצעות טרנספורמציה. טרנספורמציות מוצלחות מזוהות על ידי ביטוי של סמן ובדיקת גודל פרגמנט ה-PCR.

ולבסוף, רצף ביסולפיט משמש להערכת מצב המתילציה. היתרון המרכזי של תהליך עבודה זה הוא שהוא מאפשר ניתוח נוח של תכנות אפיגנטי בתגובה לגירויים סביבתיים. שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תכנות אפיגנטי כתוצאה מקשיים בשלבי חיים מוקדמים.

ניתן ליישם זאת גם על מערכות אחרות. בכל מקרה שבו נבדקים מתילציה וביטוי גנים בסביבה בעלת סגוליות רקמתית גבוהה ובכל מקרה שבו זמינות הרקמה מוגבלת. כדי להשרות סטרס במוקדם של החיים, מתבצעת הפרדה אימהית לגורים של נקבות C 57 black six N בהריון מתואם זמן כדי להשפיע על ההפרדה האימהית.

העבירו כל שגר להקליד נקי ומחומם למשך שלוש שעות מדי יום מהיום הפוסטנטלי הראשון ועד היום ה-10; השאירו את גורי הביקורת ללא השפעת גורמי לחץ ללא הפרעה. מלבד ההפרדה למשך שלוש שעות, כל השגרים נשארים עם אמותיהם עד לגמילה ביום הפוסטנטלי ה-21. לאחר מכן, הגורים מאוחסנים בקבוצות תואמות מינית, שלושה עד חמישה עכברים לכל כלוב, תחת תנאי מחיה סטנדרטיים. כדי להתחיל באיסוף רקמת מוח, המוחות של העכברים מוצאים מהגולגולת ומוקפאים מיד בקרח יבש (dry ice) ומאוחסנים בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius.

כאשר תהיו מוכנים לאיסוף דגימות הרקמה (tissue punches), הוציאו את המוחות מהמקפיא בטמפרטורה של 80- מעלות והניחו אותם על קרח יבש. התחילו בביצוע חיתוך קריוסטטי (cryosectioning) של המוחות לפרוסות קורונליות בעובי 10 micron, מהחלק הרוסטרלי (rostral) לכיוון הקודלי (caudal). העבירו את הפרוסאות לשקופיות זכוכית מסוג super frosts וייבשו אותן לצורך צביעת כריסטל ויולט (crystal violet).

ניתן להכין ולהקפיא סרטיות נוספות בטמפרטורה של 20- מעלות לצורך ניתוחים נוספים, כגון הibridization in situ. כאשר מתחילים בתהליך הדגימה, צבע את הסרטיות ב-crystal violet כדי לזהות את מבני המוח הרלוונטיים. לאחר מכן, בעזרת מחט דגימה, בצע דגימות של 0.8 millimeter מהאזורים הרלוונטיים באמצעות microdissection in loco.

יש לאחסן את הדגימות (punches) במינוס 80 מעלות צלזיוס. חשוב ביותר לבצע את הדגימה המיקרוסקופית (micro punching) באופן סטנדרטי, כיוון שביטוי גנים ומתיליזציה הם תלויי-רקמה באופן משמעותי. הומוגניזרו את הדגימות ב-400 µL של תמיפת qadium thiocyanate בעזרת פיפט, ולאחר מכן ערבבו במכשיר vortex בטמפרטורת החדר.

בשלב הבא, העבירו את הליזאט שהתקבל דרך מזרק בכילייב 29. חזרו על הפעולה מספר פעמים עד שהדמעסה (punch) לא תהיה נראית עוד. פצלו את הליזאט לחלקים שווים.

אחד לעיבוד RNA, אותו יש לבצע תחילה, והשני לעיבוד DNA, אותו ניתן לשמור בטמפרטורה של החדר עד לסיום עיבוד ה-RNA לטובת טיהור RNA באמצעות נפח של 1/10 סודיום אצטט, נפח אחד של aqua phenol וחצי נפח של כלורופורם לאיזואמיל ביחס של 24:1. ערבבו את התערובת ב-vortex בעוצמה לאחר כל הוספה, והדגירו את התערובת הסופית על קרח למשך 10 דקות. לאחר מכן, סבבבו את התערובת בצנטריפוגה.

אסוף את הפאזה המימית והוסף לה נפח שווה של 70% ethanol. באמצעות ערכה של עמודי ספין ל-RNA, בצע עיכול של ה-DNA על העמוד, שטוף ואלוט את ה-RNA לתוך 25 microliters של מים.

כעת טהרו את ה-DNA באמצעות פרוטוקול של ערכה ששונה כך שיכלול הוספה של עיכול RNase, וחימום של בופר האלוציה ועמודת האלוציה ל-70 °C לפני השימוש בהם. 10 דקות ב-70 °C מספיקות עבור העמודות. לבסוף, השתמשו בספקטרופוטומטר כדי לקבוע את ריכוזי ה-DNA וה-RNA.

דגימה טיפוסית של PVN באמצעות punch מניבה כ-600 nanograms של DNA וכ-400 nanograms של RNA; יש להפריש כ-100 nanograms של RNA לצורך ניתוח ביטוי גנים באמצעות quantitative PCR לפני ההגברה באמצעות sulfite. יש לטפל ב-200 nanograms של ה-DNA המבודד באמצעות ערכה זמינה מסחרית להגברת DNA מאזורים מתילתיים. יש להזמין פריימרים שתוכננו במיוחד עבור DNA שעבר המרה ב-bisulfite; תכנון אופטימלי של פריימרים ב-bisulfite PCR הוא חיוני, שכן האיכות והספציפיות של ה-PCR amplicon קובעות את הצלחתו של השלבים הבאים.

עם הגעת הפריימרים, קבעו את טמפרטורת הקישור האופטימלית שלהם באמצעות ניסויי פיילוט. השתמשו בשני µL של DNA שעבר טיפול בביסולפיט כתבנית עבור כל תערובת PCR בנפח של 25 µL.

בצע הגברה לתערובת החל משלב דנטורציה של שש דקות ב-95 °C, ולאחריו 45 עד 50 מחזורי הגברה, לפני שלב מארכה סופי של חמש דקות ב-72 °C. נתח 7 µL מתוצר ה-PCR באמצעות אלקטרופורזה בג'ל agarose כדי לוודא את גודל האמפליקון. טהר את תוצר ה-PCR שנותר לצורך ליגציה בהמשך, באמצעות ערכה מסחרית לניקוי PCR.

במידה והתקבלו תוצרי PCR לא רצויים, השתמש בטיהור בג'ל כדי לבודד את התוצר הרצוי עבור פרוטוקול זה. נעשה שימוש בערכה מסחרית לשיבוט. יעילות השיבוט תלויה באופן קריטי ברצף המוכנס (insert).

לכן, אם מתקבלים שוב ושוב מספרים נמוכים של שיבוטים רקומביננטיים, נסו וקטור שיבוט אחר. הכינו תגובת ליגציה של 10 µL עם 1 µL של וקטור ו-3 µL של תוצר PCR מנוקה. ערבבו את התגובה באמצעות פיפטור והדגרירו אותה למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C עד למחרת.

נקו את תגובת הליגציה באמצעות שיטה קלאסית של שקיעה באתנול והעבירו את המוצר לחיידקים בתהליך טרנספורמציה. הוסיפו מיליליטר אחד של מצע SOB שחומם מראש מיד לאחר מתן הפולס, והעבירו את החיידקים שעברו טרנספורמציה למבחנה של תגובה. לאחר השבת החיידקים למשך שעה אחת ב-37 °C, פזרו 100 µL מכל תרחיף על צלחת LB עם ampicillin המצופה ב-IPTG.

דגרו את הצלחות הגידול למשך לילה עד שניתן יהיה לבודד מושבות. הכינו תגובות colony PCR של 25 microliter בצלחת 96 בארות, תוך שימוש ב-three microliters של 2.5 millimolar magnesium chloride בכל תגובה. בחרו שיבוטים לבנים חיוביים בעזרת טיפ פטה והעבירו אותם לתערובת ה-PCR באמצעות טבילה פשוטה.

התחל את תגובת ה-PCR במחזור המסה של ארבע דקות. לאחר מכן, בצע 10 מחזורי הגברה בטמפרטורת annealing של 56 °C. כל שלב במחזורים אלו נמשך 30 שניות.

לאחר מכן הנמיכו את טמפרטורת ההדבקה ל-48 °C למשך 30 מחזורי הגברה נוספים. סיימו במחזור הארכה של חמש דקות. כעת טענו 5 µL מכל תוצר על ג'ל agarose וזהו את התגובות המכילות מקטע (insert) בגודל הנכון.

השתמשו בערכה זמינה מסחרית לניקוי תוצרי ה-PCR הרצויים, כדי שניתן יהיה לבצע להם ריצוף באמצעות שיטת BigDye Terminator cycling sequencing. בלוחית של 96 בארות, טענו לבארות שלושה µL של תערובת ריאקציה (master mix) של BigDye, ולאחריה שני µL של תוצר colony PCR מנוקה. הריצו את התגובה בטרמוסייקלר, החל מדקה אחת ב-96 °C, ולאחריה 35 מחזורים של 10 שניות ב-96 °C, חמש שניות ב-50 °C, וארבע דקות ב-60 °C.

לאחר סיום תגובת ה-big die, נקה את התגובה באמצעות לוח טיהור big die. לאחר קבלת הרצפים, נתח אותם באמצעות ה-big analyzer המקוון או כלי ה-B-I-S-M-A כדי להסיק את תבנית המתילציה של אזור ה-DNA הנחקר, במטרה להבין את השפעת סטרס במוקדם החיים או ELS על ביטוי וסטטוס מתילציה של a VP. עכברים מסוג C 57 black sticks עובדו בהתאם לפרוטוקול המתואר, הגרעין הפרבנטריקולרי והגרעין הסופראופטי נדגרו כדי לבודד DNA ו-R-N-A; ה-D-N-A עבר טיפול בביסולפיט והוגבר עם פריימרים ספציפיים ל-a VP enhancer, ותוצרי ה-PCR שובטו ורוצפו, כאשר לפחות 20 שיבוטים רקומביננטיים מכל עכבר נבדקו.

בוצע ניתוח לתוצרי PCR כדי לקבוע את תדירויות המתילציה עבור ה-CPGs הכלולים באמפליקון ה-PCR ברקמה מה-P-V-N-E-L-S, אשר גרם להיפומתילציה משמעותית בארבעה מיקומים במגביר של A VP, מה שמרמז על סימון אפיגנטי של אזור רגולטורי זה דרך חוויות בשלבי החיים המוקדמים. בניגוד ל-PVN, המתילציה של מגביר A VP לא הושפעה מ-ELS ב-SON, מה שממחיש את הספציפיות הרקמתית של האפקט האפיגנטי. בבעלי חיים של קבוצת ביקורת, מצב מתילציית ה-DNA ב-CPG 10 נמצא במתאם שלילי עם ביטוי הגן של a VP, מה שמעיד על תפקידה של מתילציית DNA בכוונון עדין של ביטוי הגן a VP. לאחר הליך זה, ניתן לבצע בקלות שיטות אחרות כמו UPCR על ה-RNA המבודד כדי לענות על שאלות נוספות, כגון שינויים בביטוי גנים ברקמה המנותחת.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן חקירת שינויים במתילציה של DNA בתגובה לגירויים סביבתיים או כאלו התלויים בניסיון.