מיקרומניפולציה של ביטוי גנים במוח דג הזברה למבוגר באמצעות Microinjection Cerebroventricular של oligonucleotides morpholino

המטרה הכוללת של הליך זה היא להזריק מיקרו אוליגונוקלאוטידים מורפים לחדר המוח של מוח דג הזברה הבוגר ולהפיל את פעילות הגנים בתאי גליית הרדיו. זה מושג על ידי הרדמה ראשונה של דג הזברה. לאחר מכן, נוצר חריץ בגולגולת, המכסה את הבטן האופטית באמצעות מחט שקע דוקרנית.

לאחר מכן מוזרקת תמיסת המורפו דרך אתר החתך לנוזל החדר במוח. לבסוף, יעילות ההזרקה והדיוק נבדקים תחת מיקרוסקופ הקרינה. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות של חסימה יעילה ונרחבת מדי של ייצור חלבון מהגנים המעניינים בתאי הגליה הרדיאליים של מוח דג הזברה הבוגר באמצעות הפלת גנים בתיווך מורפו, שניתן להעריך על ידי חתכים היסטולוגיים וצביעה אימונוהיסטוכימית.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות, כמו גישות טרנסגניות או שיטות אספקה מבוססות פעולה אלקטרו, הוא ש-CVMI גוזל פחות זמן, יעיל יותר במיקוד לכל אוכלוסיית תאי גליית הרדיו. ניתן להפיל את הגנים המתכווננים והרבים הללו בו זמנית. להכנת תערובת ההזרקה התחל בהכנת תמיסת מלאי 500 מיקרומולרית מורפו.

באמצעות PBS להזרקה של 10, הכינו 10 מיקרוליטר של תערובת הזרקה על ידי שילוב של תשעה מיקרוליטר של תמיסת מורפו מדוללת או לא מדוללת עם מיקרוליטר אחד של צבע מעקב פלואורסצנטי. אחסן אותו בטמפרטורת החדר. השתמש במושך מחט להכנת נימי הזרקת זכוכית על פי הפרמטרים הבאים.

הפעל את מקור הלחץ והתאם את הגדרות הלחץ ל-50 PSI או 3.5 בר. התאם את הגדרות מזרק המיקרו באופן הבא. לחץ החזק 20 PSI לחץ פליטה 10 PSI ערך תקופה 2.5 ו-100 אלפיות השנייה.

טווח שער. הפעל את תאורת הטבעת ואתר את הטבעת מעל שלב המיקרוסקופ. הנח את מחזיק הנימים במיקום מתאים ליד המיקרוסקופ.

הכנס את נימי הזכוכית לתוך המחזיק והתאם את זווית ההזרקה ל-45 מעלות. בעזרת מלקחיים למצוא, נתק את קצה נימי הזכוכית וכייל את תפוקת הלחץ מהפתח. על ידי טבילת קצה המחט במי הדגים והפעלת דופק לחץ רציף, בועות האוויר צריכות ליצור שורה אחת המציינת לחץ אופטימלי או גודל פתח.

טען את נימי הזכוכית בתמיסת ההזרקה. הימנעות מבועות אוויר הפעל לחץ כדי להסיר את האוויר בין קצה נימי הזכוכית לתמיסת ההזרקה הטעונה. לאחר הכנת תמיסת גבעול של 0.1% של חומר ההרדמה, העבירו את מספר הדגים הרצוי למיכל הובלה עם מי דגים.

הכן תמיסת עבודה של חומר הרדמה על ידי ערבוב 200 מיליליטר מי דגים עם חמישה מיליליטר תמיסת מלאי MISP. מלאו צלחת פטרי באמצע הדרך בחומר ההרדמה כדי להשתמש בה לזריקות. דגרו דג בהרדמה עד שהוא מפסיק לנוע.

לאחר מכן השתמש ברשת כדי להעביר אותו לצלחת פטרי של חומר הרדמה. כדי להקל על החתך, השתמש במלקחיים כדי להחזיק בעדינות את הדג ולכוון אותו כשראשו מוטה מעט כלפי מטה. בעזרת קצה של מחט דוקרנית בקוטר 30, צור חריץ קטן בגולגולת מבלי לחדור עמוק מדי מכיוון שהדבר יגרום נזק לרקמת המוח.

תוך כדי החזקת הדג, הכניסו את קצה נימי הזכוכית דרך מקום החתך כחצי מילימטר, ותוך הימנעות ממגע עם רקמת המוח, כוונו אותו לכיוון הצפלון. הזרקו את התמיסה, היא אמורה להתפזר מיד. מעבירים את הדג למי דגים טריים ומניחים לו להתאושש.

כ-30 דקות לאחר מכן, הרדימו מחדש את הדג ובדקו אותו במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לחפש פיזור נרחב של הנוזל. מבוסס על פלואורסצנטיות אדומה. החזירו את הדג למיכל שלו והחזירו אותו למחזור.

עד לשימוש לניתוחים התנהגותיים או להכנת דגימות רקמה כפי שניתן לראות כאן, הזרקה מדויקת מובילה לפיזור התמיסה המוזרקת ברחבי המוח ומיקוד יעיל של התאים הקרובים לפני השטח של החדר. עם זאת, בהזרקות שבהן נימי הזכוכית חודרים, לרקמת המוח יהיה אות פלואורסצנטי צפוף בנקודת ההזרקה. ואם הכמות המוזרקת אינה מספיקה, ייצפה אות פלורסנט חלש.

איור זה מדגים כי vivo morphos יכול לחדור כמה קוטרי תאים בתוך פני השטח של החדר, ולכן יכול לכוון ביעילות לתאי החדר בהשוואה לביקורת. מורפו. הזרקת מורפו כנגד PCNA מפילה ביעילות את ביטוי הגנים בתאי החדר. בתמונות אימונופלואורסצנטיות אלה, צביעה חיסונית BRDU ו-QCD לאחר ניסוי מרדף דופק A-B-R-D-U מדגימים כי הפלה של PCNA עם מורפוזות אנטי-סנס מובילה להפחתה משמעותית בתאי עצב שזה עתה נולדו, מה שמרמז על כך שניתן להשתמש ב-CVMI כדי להפיל גנים אנדוגניים שלאחר מכן מובילים להשלכות תפקודיות.

לכן, לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח לחקור את המנגנונים המולקולריים המעורבים בתגובת הנוירוגנזה המחודשת של ה-S הבוגר של מוח הדג.