שליטה על גודל, צורה ויציבות של פולימרים מולקולריים במים

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לשלוט בגודל, בצורה וביציבות של ננו-חלקיקים דינמיים על-מולקולריים במים. מטרה זו מושגת באמצעות תכנון של מגבירים (amplifiers) דיכרואיים המתבצעים בהרכבה עצמית או בפולימריזציה, אשר המבנה המולקולרי שלהם מצופה כך שייווצרו הן אינטראקציות משיכה והן אינטראקציות דחייה. התוצאה היא מנגנון גדילה מתוסכל (frustrated growth mechanism) המניב ננו-חלקיקים בהרכבה עצמית במים בעלי צורה כדורית מבוקרת.

כשלב שני, ריכוז המלח של התמיסה המימית מוגדל, דבר המהחלש את האינטראקציות הדחוקות המקודדות במבנה המולקולרי של ה-disco amphi. פעולה זו משרה מעבר מצורה של כדור לצורה של מוט. נערכו בדיקות ספקטרוסקופיות של דיכרואיזם מעגלי (CD) התלויות בטמפרטורה כדי לחשוף את המנגנונים העומדים בבסיס מעבר זה מכדור למוט. בנוסף, נעשה שימוש בשילוב של טכניקות אנליטיות כגון מיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת בקירור (cryogenic transmission electron microscopy) ותהודה מגנטית גרעינית (NMR) כדי למדוד ולהדמין את המעבר מסוג אחד של אגרגט למשנהו. התוצאות שהתקבלו מראות כי המעבר מכדור למוט בא לידי ביטוי בקו-אופרטיביות מוגברת בפולימריזציה הסופרא-מולקולרית.

מקור התופעה הוא במעבר מתהליך אנטי-קו-אופרטיבי בננו-חלקיקים בעלי גודל מוגבל, למנגנון התארגנות גרעינית והארכה קו-אופרטיבי מלא, אשר מוביל במקרה זה לפולימרים סופר-מולקולריים גדולים מאוד, שהם ננו-מוטות דינמיים. היתרון המרכזי בשילוב של טכניקות ספקטרוסקופיות כגון ספקטרוסקופית CD, פיזור קרני X בזוויות קטנות ו-NMR עם טכניקות מיקרוסקופיות כגון cryo, הוא היכולת למדוד ולהציג ויזואלית מעברים של פולימרים סופר-מולקולריים במים. פולימרים דינמיים אלו יכולים להגיב לגירויים חיצוניים כגון שינויים בטמפרטורה, שינויים בעוצמת ה-OnX או שינויים ב-pH.

השילוב של שיטות אלו הוא בעל יישום רחב ויכול לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחומי הכימיה המולקולרית וננו-חומרים בהרכבה עצמית. לדוגמה, ניתן לחקור את המתאם בין ממדי האגרגטים הנוצרים על ידי הרכבה עצמית של אבני בנייה מולקולריות קטנות לבין מנגנוני ההיווצרות העומדים בבסיסן. ההשלכות של מתודולוגיה זו משתרעות על פני מגוון רחב של יישומים בביו-ננו-טכנולוגיה.

התעניינו במיוחד בתחום ההדמיה הביו-רפואית ובפיתוח חומרי ניגוד ננו-חלקיקיים המרכיבים את עצמם, כאשר איזון עדין בין יציבות האגרגטים, ניגודיות גבוהה והיכולת להפריש את חומרי הניגוד המרכיבים את עצמם הוא בעל חשיבות עליונה להצלחתם בשימוש קליני. הרעיון לשלב טכניקות אפיון עלה תחילה כאשר הבנו ששינויים דקים במבנה המולקולרי של אבני הבניין המרכיבות את עצמנן עלולים להוביל להבדלים יסודיים במנגנון הפולימריזציה הסופרא-מולקולרית. את הפרוצדורה יעגש פול בומונט, המומחה האחראי על מתקני ה-cryo 10 באוניברסיטה הטכנית של טרוואן.

התחילו את הפרוטוקול זה בהכנת תמיסת BTA gadolinium DTPA בבופר ציטראט 100 millimolar כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. בהמשך לסרטון זה, מלאו קוvette UV בגודל one centimeter בתמיסה. הכניסו את ה-qve לתוך מחזיק ה-qve בספקטרומטר ה-D crowism המעגלי.

מדוד ספקטרום CD מ-230 עד 350 ננומטר. לאחר מכן, מדוד עקומת קירור CD בפס CD בעל העוצמה הגבוהה ביותר מ-363 עד 283 קלווין בקצב של קלווין אחד לדקה. לאחר מכן, הוסף את אותו הנפח של תמיסת רסס (buffer) של sodium chloride בריכוז שני מולארי אל תמיסת הרסס של citrate של BTA gadolinium DTPA.

פעולה זו תעלה את העוצמה היונית לריכוז של 1 M נתרן כלורי ותדלל את הדיסקים (discos) למחצית מהריכוז. לאחר העלאת העוצמה היונית, ערבבו את התמירון באמצעות וורטקס במשך 40 שניות, ומדדו שוב ספקטרום CD בטווח שבין 230 ל-350 ננומטר. לאחר מכן, מדדו עקומת קירור CD בפס ה-CD בעל העוצמה הגבוהה ביותר בטווח שבין 363 ל-283 קלווין, בקצב של 1 קלווין לדקה.

ייצא את נתוני ה-CD הגולמיים לתוכנת origin 8.5. נרמל את הספקטרה על ידי הגדרת אפקט ה-CD בטמפרטורה הגבוהה ביותר שנמדדה כשווה לאפס, ואפקט ה-CD בטמפרטורה הנמוכה ביותר שנמדדה כשווה לאחד. מכיוון שגודלו של אפקט ה-CD פרופורציונלי לדרגת האגרגציה, עקומות ה-CD המנורמלות הן פרופורציונליות לדרגת האגרגציה. הנתונים המנורמלים מותאמים באמצעות אפשרות התאמה לעקומה לא ליניארית ב-origin Pro 8.5 עם מודל הרכבה עצמית תלוי טמפרטורה.

במודל זה, מבחינים בין משטר גרעין (nucleation) למשטר התארכות (elongation). ראשית, התאם את דרגת האגרגציה במשטר ההתארכות. במשוואה זו, T מייצג את הטמפרטורה המשתנה.

PHI N הוא ההליסיטי נטו (net helicity), אשר פרופורציונלי לדרגת האגרגציה, ו-HE היא האנתלפיה המולקולרית של ההארכה. T TE מייצג את טמפרטורת ההארכה, שהיא הטמפרטורה שבה ההרכבה העצמית מתחילה להיות מועדפת תרמודינמית. מקדם הנורמליזציה fiat מוצג כדי להבטיח ש-Phi N חלקי fiat לא יעלה על אחד, הנובע מהמגבלה שדרגת האגרגציה אינה יכולה לעלות על ערך זה.

התאמה לאחדות (Unity fitting) מאפשרת לחלץ את האנתלפיה של ההארכה בג'ול למול ואת טמפרטורת ההארכה בקלווין המאפיינת את ההרכבה העצמית של המולקולות עבור ריכוז נתון. בעת ההתאמה, יש להקפיד על המגבלה שרק דרגת האגרגציה בטמפרטורות הנמוכות מ-TE תותאם, מכיוון שהמשוואה תקפה רק במשטר ההארכה. לאחר התאמת המשוואה הראשונה, הפרמטר הבלתי ידוע היחיד במשוואת משטר הגרעין הוא קבוע ההפעלה ka, המתאר את השיתופיות של הפולימריזציה הסופרא-מולקולרית. כדי למצוא את קבוע ההפעלה, התאם את דרגת האגרגציה שנמצאה בניסוי עבור טמפרטורות הגבוהות מ-TE במשטר הגרעין.

התחילו בהכנת תמיסות למיקרוסקופיה אלקטרונית כפי שמתואר בטקסט. הכינו בקצרה שני תמיסות חוצץ (בופרים), תמיסת חוצץ ציטראט 100 millimolar, ותמיסת חוצץ ציטראט 100 millimolar עם sodium chloride בריכוז five molar. המיסו BTA gadolinium DTPA ב-0.1 milliliters של כל אחד מהבופרים שהוכנו כדי להגיע לריכוז סופי של one millimolar. לאחר מכן, בצעו טיפול פלסמה לסבב (grid) quanti foil מצופה פחמן באמצעות C Resington 2 0 8 carbon coer הפועל ב-five milliamps למשך 40 שניות.

הליך הוויטריפיקציה (הקפאה זכוכיתית) הוא שלב קריטי בקריו-מיקרוסקופיה, שכן הוא מבטיח ששכבה דקה של ISIS מבריקה שנוצרה תהיה מתאימה לניתוח TAM. התמיסה המימית מומרApplied על הגריד במהלך הוויטריפיקציה באמצעות vitro bot אוטומטי של FEI. תהליך זה כולל הנחת הדגימה על הגריד, ספיגה של עודפי נוזלים ליצירת סרט דק של התמיסה המימית על הגריד, וביצוע ויטריפיקציה על ידי טבילה מהירה מאוד של הגריד ב-Ethan נוזלי.

לאחר הוויטריפיקציה, העבירו את הרשת המטופלת לחנקן נוזלי לצורך שימורה, ולאחר מכן העבירו ידנית את רשת הדגימה לקסטת טעינה אוטומטית (autoloader cassette), המקוררת אף היא בחנקן נוזלי. השלב הבא הוא להכניס את הקסטה לתוך ה-TUE cryo Titan, טוען אוטומטי של TEM. ה-TUE Cryo Titan מצויד ברובה פליטה שדה (field emission gun) הפועל במתח של 300 kilovolts.

הקלטת תמונות TAM דורשת ניסיון וטיפול מהיר. זאת מכיוון שאלומת אלקטרונים בעלת אנרגיה גבוהה פוגעת בדגימה במהלך ההדמיה. הקליטו תמונות באמצעות מצלמת CCD המצוידת במסנן אנרגיה עם שער לאחר העמוד (post column gating energy filter). מאחר שגדולניום הוא פאראמגנטי מאוד ואותות פרוטונים יתרחבו כתוצאה מכך באופן משמעותי, נעשה שימוש בדיסקו שונה שבו הוחלף הגדולניום ביטריום דיאמגנטי ובממס של BT atrium.

הכינו את ה-DTPA. חשבו כמה מיליגרמים של BT atrium DTPA בעל משקל מולקולרי של 2,979 גרם למול דרושים כדי להגיע לריכוז יעד של מילימול אחד. המשיכו להמיס את הכמות שנקבעה של BT atrium DTPA בבופר סוקסינאט (succinate buffer) בריכוז 50 מילימול ב-D₂O, ולאחר מכן העבירו בעזרת פיפט 0.6 מיליליטר מהתמיסה שהתקבלה לתוך מבחנת NMR של wilm, a LABAs.

הכנס את הדגימה ליחידה משתנה בספקטרומטר Nova 500 המצויד בProbe מסוג I-D-P-F-G של חמישה מילימטרים מחברת Varian. בצע את ניסויי ה-DOI כפי שנדון בטקסט, לאחר הקלטת NMR פרוטון סטנדרטי תוך התאמת פולס של 90 מעלות ואופטימיזציה של זמני הערבוב בהתאם. רצף הפולסים של DOI one-shot משמש לאחר קביעת הדיפוזיה העצמית של HDO בProbe ייחוס שחלאות, ובדגימה נקבע מקדם הדיפוזיה של האגרגטים, שדרכו ניתן לחשב את הרדיוס ההידרודינמי.

לבסוף, חשבו את הרדיוסים ההידרודינמיים RH של הצבירים באמצעות יחסי סטוקס-איינשטיין עבור דיפוזיה של חלקיק כדורי. האופי היוני של קומפלקסי ה-gadolinium DTPA ההיקפיים יוצר תסכול בצמיחה החד-ממדית של המonomers הדיסקו, שגרעינם תוכנן להתפולימר לצבירים מוארכים דמויי מוט. האיזון בין אינטראקציות משיכה לדחייה שולט על גודלם וצורתם של הצבירים.

מקור סינכטרון הוא טכניקה רבת עוצמה לקביעת הגודל והצורה של חלקיקים ותמיסות. פיזור קרני רנטגן בזווית קטנה, או SAXS. Gd-DTPA הומס בתמיסת בופר ציטראט ופרופילי ה-SAXS תועדו בשני ריכוזים שונים.

שיפוע השואף לאפס באזור Q נמוך מעיד על חוסר בצורה ובאיזוטרופיות של הצבר, מה שמרמז על נוכחות של עצמים כדורית. הנתונים שנמדדו בריכוזים שונים הותאמו לגורם צורה כדורי מונו-דיספרסי הומוגני, מה שהוביל לרדיוס מחושב של 3.2 nanometers. הרדיוס הגיאומטרי המחושב של מונומר disco, BTA gadolinium DTPA הוא 3.0 nanometers, דבר המעיד על נוכחות של צברים עם יחס גובה-רוחב הקרוב לאחד, כדי לספק ראיות נוספות לצורה הכדורית ולגודל הננומטרי של העצמים המורכבים עצמית.

בוצעו מדידות ספקטרוסקופיית NMR בעלת סדר דיפוזיה של פרוטונים. NMR מסוג DOI מאפשר קביעת מקדמי הדיפוזיה של אגרגטים על-מולקולריים, מהם ניתן לחשב את הרדיוס ההידרודינמי שלהם. מקדם הדיפוזיה של המגביר הדיכרואי הדיאמגנטי המאגרגט במבחנה עם בופר סוצינאט דאוטרטי נקבע להיות 0.69 × 10⁻¹⁰ m²/s באמצעות קשר סטוקס-איינשטיין.

רדיוס הידרודינמי של 2.9 nanometers חושב עבור העצמים הבודדים בעלי גודל כדורי. גודל זה תואם היטב לערך שהתקבל מנתוני SOX עבור BTA gadolinium DTPA. ראיות נוספות לשליטה מוצלחת באורך הערימה החד-ממדית התקבלו ממיקרוגרפים של cryo TEM.

BTA gadolinium DTPA מייצר את העצמים הכדוריים הצפויים עם קטרים הקרובים ל-6 nm בריכוז של 1 mM, מה שמאשר את התוצאות ממדידות so ו-DOI. היווצרות של פולימרים סופרא-מולקולריים דמויי מוט בעלי יחס רב-היבט גבוה נצפתה בבירור במיקרוגרפים של cryo te בחוזק יוני גבוה. סיכוך אלקטרוסטטי הוא ההסבר הסביר ביותר לממצא זה.

הצורה משתנה מצביר כדורי שקוטרו כ-6 ננומטרים למוטות מוארכים בעלי קוטר של 6 ננומטרים ואורך של עד כמה מאות ננומטרים. כאן מוצגים ספקטרום CD בטמפרטורת החדר של BTA Gadolinium DTPA בריכוזי מלח עולים. ריכוז ה-BTA gadolinium DTPA הוא 8×10⁻³ מילימולארי בחוזק יוני נמוך ו-4×10⁻³ מילימולארי בחוזק יוני גבוה.

למרות שריכוז נמוך משמעותית מיושם עבור מדידות ה-CD, אפקט הכותנה הברור מעיד על נוכחותם של אגרגטים שלמים אפילו בריכוזים מיקרומולריים. צורת ספקטרום ה-CD משתנה עם העלאת ריכוז המלח, דבר המהווה אינדיקציה טובה להפחתה באינטראקציות הדחייה בפריפריה של הערימות (stacks) ואריזה משופרת של ה-decos. בנוסף, עקומות קירור ה-CD של אותן תמיסות מראות הבדלים ברורים בצורה.

הטמפרטורה שבה מתחילה האגרגציה זזה לטמפרטורות גבוהות יותר בריכוזי מלח גבוהים יותר. מנגנון שיתופי (cooperative) גובר הופך גלוי גם הוא, כפי שמאופיין על ידי עלייה חדה יותר באפקט ה-CD, בעוד שעקום הקירור בריכוז של 0 molar של sodium chloride מתואר בצורה הטובה ביותר על ידי מודל הרכבה עצמית ISO smic המעיד על תהליך אנטי-שיתופי. עקום הקירור בריכוז של 1.0 molar של sodium chloride אופייני לתהליך הרכבה עצמית שיתופי וניתן לתאר אותו באמצעות מודל גרעין-הארכה (nucleation elongation) המכמת את הפרמטרים התרמודינמיים של ההרכבה העצמית של BTA gadolinium DTPA בריכוזים של 0 ו-1 molar של sodium chloride.

שימוש במודל קואופרטיבי חושף בבירור את הירידה ב-ka, שהוא קבוע ההפעלה חסר הממדים. ערכים נמוכים יותר עבור KA מעידים על דרגה גבוהה יותר של קואופרטיביות בתהליך ההרכבה העצמית, המתבטאת ביצירת פולימרים סופראמולקולריים מאורכים מאוד. כפי שנצפה ב-cryo TEM, בעת ניסיון ליישם את הטכניקות הניסיוניות שהודגמו, חשוב לזכור שרק שילוב של שיטות ניסיוניות יוביל לתיאור כולל ומשמעותי של הננו-חומרים הדינמיים הנחקרים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תגמירו עם הבנה טובה לגבי מידת הישימות הרחבה של הגישה הניסויית המשולבת שלנו, וכיצד היא יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחום של ננו-חומרים בהרכבה עצמית וסופר-פולימרים.