התאמה אישית של אספרגילוס ניז'ר מורפולוגיה באמצעות תוספת של חלקיקי טלק מיקרו

שיטה זו מייצרת ומאפיינת מבנים מורפולוגיים של הפטרייה Filamentous fungus, בשם Aspergillus niger, התלויים במיקרו-חלקיקים, וזאת כדי לבחון את המתאם בין המורפולוגיה הפטרייתית לבין הפרודוקטיביות. גדלו Aspergillus niger עם או ללא מיקרו-חלקיקים בביוראקטור מסוג מיכל ערבוב בנפח של 3 liters למשך 72 שעות כדי לחשב את הפרודוקטיביות הספציפית. קחו דגימות בנקודות זמן מוגדרות וקבעו את המסה הביולוגית, המשקל היבש ואת פעילות ה-beta-fructosidase.

לאחר 72 שעות, בחנו את המורפולוגיה הפטרייתית באמצעות מיקרוסקופיה ואפיינו אותה באמצעות ניתוח תמונות דיגיטלי. לאחר מכן, שלבו פרמטרים רלוונטיים של ניתוח התמונה למספר מורפולוגי המתאם מתמטית לפרודוקטיביות הספציפית. בסופו של דבר, שיטה זו יכולה להפיק באופן מדויק ולאפיין באופן מקיף את המורפולוגיה של *Aspergillus niger* להבנה טובה יותר של המורפוגנזה של מיקרואורגניזמים filaments.

Aspergillus niger מהווה סוס עבודה תעשייתי חשוב בביוטכנולוגיה כבר עשורים רבים. אחת התכונות המרתקות והבלתי נשלטות ביותר של A. niger ומינים דומים היא המורפולוגיה המורכבת שלהם, הנעה בין גושי פלטים (pellets) כדוריים ודחוסים לבין מיצליום צמיגי, בהתאם לתנאי התרבית. היתרון המרכזי של הפרוצדורה שלנו הוא שבאמצעות הוספת מיקרו-חלקיקים, אנו יכולים כעת להתאים באופן ספציפי את המורפולוגיה הפטרייתית לצרכי התהליך.

עד כה, לא תוארה שום שיטה אחרת להתאמה אישית כזו של מורפולוגיה פטרייתית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנוגע לגידול של מיקרואורגניזמים פילמנטריים. זאת מכיוון שעבור יישומים תעשייתיים, חיוני לשלוט במורפולוגיה הפטרייתית וכן להבחין בין מורפולוגיה פטרייתית בעלת תפוקה גבוהה לזו בעלת תפוקה נמוכה.

הפרוטוקול שלנו מספק את האמצעים להתאמה אישית ואפיון רצויים של מורפולוגיה פטרייתית. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי המורפולוגיה של *Aspergillus niger*, ניתן ליישמה גם על מיקרואורגניזמים חוטיים אחרים, כגון זני *Penicillium* או *Streptomyces*. הכינו ארבעה ביו-ריאקטורים לתרביות סטריליות כפי שמפורט בפרוטוקול הנלווה.

טקסט המבוסס על הוספת מיקרו-חלקיקים, גידול של aspergillus Niger בעל מורפולוגיות שונות. לאחר 72 שעות, העבירו 50 מיליליטר של דגימות ממרק התרבית לשפופרת פלקון (Falcon tube).

יש לדגום דגימות ביומסה לפחות בשכפולים לאחר ייבוש בדסיקטור; שקלו מסנן תאית באמצעות מאזניים מיקרוסקופיים. הניחו את המסנן במשפך בוכנר המחובר למשאבת ואקום מסוג jet water, סננו 10 milliliters של דגימה ולאחריהם 10 milliliters של מים דה-יוניים כדי להסיר תרכובות מהמצע, וקמטו את המסנן פעם אחת במרכזו.

הניחו את המסנן בתוך צלחת פטרי מזכוכית והכניסו למייבש תאים עד להשגת משקל קבוע. העבירו את המסנן למייבש (desiccator) והמתינו לקירור. לאחר מכן, מדדו את המשקל.

חשבו את משקל היבש של הביומסה לליטר באמצעות חישוב המשקל, הפרש המשקלים של המסננים, וחלוקה עוקבת בנפח הדגימה עבור בדיקות האנזימים גלוקוז אוקסידאז ופרוקסידאז. שמרו את הדגימות על קרח באמצעות העברה במזרק, 1.5 milliliters. סינונו של תרחיף התרבית דרך מסנן צלולוז אצטט אל תוך מבחנת תגובה לצורך ביצוע בדיקת beta fructo SASE.

על מנת להבטיח הצלחה ודיוק סטטיסטי, נבצע את הבדיקה בשלוש חזרות לכל דגימה. לתחילת הבדיקה, העבירו 20 µL מהדגימה למבחנה. כדי לשלוט על פירוק הסוכרוז לגלוקוז התלוי ב-pH ובטמפרטורה, השתמשו ב-20 µL של מים דה-יוניים במקום ב-20 µL מהדגימה. כמו כן, הכינו עבור כל דגימה בקרת שלילה לבדיקת שאריות גלוקוז במצע התרבית.

20 µL של דגימה שעברה דה-אקטיבציה בחום. כדי להתחיל את התגובה של סוכרוז לגלוקוז, הוסף 200 µL של תמיסת סוכרוז בריכוז 1.65 M. ב-pH 5.4 ל-20 µL דגימה, דגור את כל מבחנות התגובה בבלוק חימום בטמפרטורה של 40 °C למשך 20 דקות. עצור את התגובה על ידי חימום ב-95 °C למשך 10 דקות, לאחר קירור של המבחנות על קרח.

סבב את הדגימות בצנטריפוגה בעת הצורך, ומיהל אותן עבור הבדיקה כך שהבליעה הנמדדת תהיה בטווח הערכים המכויל. כעת, עבור כל תגובה, הוסף שני מיקרוליטרים של דגימה לתוך פלטת מיקרוטיטר. בצע את מדידות הדגימות בשלוש חזרות.

הכינו בנוסף עקומת סטנדרט עבור 10 תמיסות גלוקוז בריכוזים הנעים בין 1 millimolar ל-15 millimolar. עבור כיול נקודת האפס, השתמשו ב-2 µL של מים דה-יוניים. לאחר מכן, הוסיפו לכל אחת 200 µL של תמיסת הראגנט.

יש להדגיר למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. יש למדוד את הבליעה באורך גל של 450 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלט (Microplate reader) מדגם sunrise בעל 96 בארות ותוכנת שליפת הנתונים Magellan. פתחו את תרשים התוצאות בגיליון אלקטרוני והבניו קו כיול של עקומת סטנדרט.

חשבו את הפעילות עבור כל דגימה. לאחר מכן, חשבו את פעילות ה-beta fructosidase על ידי חיסור ערכי הביקורת השלילית המתאימה מפעילות הדגימה. לבסוף, חשבו את הפרודוקטיביות הסגולית על ידי שקלול משקל היובש של הביומסה ופעילות ה-beta fructosidase.

העבירו שלושה מיליליטרים של תרחיף תרבית לצלחת פטרי מפלסטיק ודללו באמצעות תמיסת סודיום כלוריד פיזיולוגית כדי להפריד בין המבנים המורפולוגיים. לאיכות התמונות המיקרוסקופיות יש חשיבות יוצאת דופן. לצורך ניתוח התמונות העוקב, יש לנקוט משנה זהירות במהלך שלב הדילול.

מקמו את צלחת הפטרי תחת מיקרוסקופ הכולל מצלמה מובנית. רכשו ושמרו כ-100 תמונות של מבנים מורפולוגיים לכל דגימה, תוך הבטחה שלפחות אובייקט אחד מצולם במלואו בכל תמונה. המשיכו באופן זה עם צלחות המכילות דגימות מכורים שונים, ורכשו תמונות חדשות בכל פעם.

שימו לב לצורות הגדילה המורפולוגיות השונות של דגימות מראקטורים שונים שגודלו עם כמויות משתנות של אבקת טלק שהוספה. לאחר מכן, פתחו את כל התמונות של אותה דגימה בתוכנת עיבוד התמונות Image J. באמצעות כלי העיבוד (process tool), הפכו את התמונה לבינארית.

המיר את התמונות לשחור ולבן כדי להחיל את הפקודה על סדרה שלמה של תמונות. השתמש כעת בקוד מאקרו, פתח אחת התמונות המכילה סרגל כיול (scale bar). העבר קו ישר על פני סרגל הכיול כדי לקבוע את מספר הפיקסלים המתאימים ל-2000 microns.

בחר בכלי הניתוח (analyze tool), הגדר את המדידה ובחר את גורמי הצורה (shape factors), ה-ferrets, הקוטר, השטח וההיקף. השתמש בקוד מאקרו כדי לעבד סדרה של תמונות. כעת פתח את גיליון הנתונים המציג את תוצאות ערכי גורמי הצורה.

עבור כל תמונה, חשבו מספר מורפולוגיה עבור כל אחת מהתמונות של דגימה אחת. חשבו את ערך הממוצע של מספר המורפולוגיה. השתמשו בתוכנה לגרפים וניתוח נתונים כדי לשרטט את מספר המורפולוגיה אל מול הפרודוקטיביות הספציפית.

קבע את הקשר המתמטי באמצעות רגרסיה מתמטית על ידי הוספה של ריכוזים עולים של מיקרו-חלקיקי טלק. שמונה Niger SKAN 10 15. המורפולוגיה משתנה ממורפולוגיית גרגר (pellet) אמיתית למורפולוגיה מפוזרת או אפילו מורפולוגיית my, שכן מורפולוגיית גרגר צפויה תחת תנאים סטנדרטיים.

מעניין לציין כי מורפולוגיה מיצלית נוצרת על ידי תוספת של 10 גרם לליטר של מיקרו-חלקיקי טלק למצע. במקביל, פעילות ה-Beto Fructo tase עולה פי שלושה בקירוב; תוספת של גרם אחד או שלושה גרם לליטר של אבקת טלק מובילה למורפולוגיה מפוזרת עם פעילות פרוקטוז כפולה, על פי פרמטרים שנקבעו באמצעות ניתוח תמונה אוטומטי. ניתן לתאר באופן מקיף את המורפולוגיה התלויה במיקרו-חלקיקים באמצעות מורפולוגיה.

שימו לב כי עבור חלקיקים אלה, פלטים עגולים ובעלי פני שטח חלקים יופיעו בתמונות מיקרוסקופיות כמעגלים מושלמים. למספר המורפולוגיה יש ערך השואף לאחד בתנאי סטנדרט. המורפולוגיה בריאקטור 1 מראה מספר מורפולוגיה של כ-0.8.

המורפולוגיה בריאקטור ארבע עם 10 גרם לליטר. אבקת טלק מאופיינת במספר מורפולוגיה סביב 0.1. מספר המורפולוגיה עבור ריאקטורים שתיים ושלוש, עם ריכוזי אבקת טלק של גרם אחד ושלושה גרם לליטר, נע בין שני הקצוות הללו ומעיד על מורפולוגיה מפוזרת.

מאחר שהמורפולוגיה התלויה במיקרו-חלקיקים קשורה קשר הדוק לפרודוקטיביות של beta fructose cytes, קיים מתאם מתמטי טוב בין המורפולוגיה, המספר והפרודוקטיביות לאחר פיתוחן. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביוטכנולוגיה להעמיק במחקר של מורפולוגיה פטרייתית, ובמיוחד בקשר שלה לפרודוקטיביות. בעקבות הליך זה של יצירה מפורטת של סוגי הכלאות פטרייתיות מורפולוגיות ספציפיות, ניתן לבחון היבטים חשובים אחרים של גידול מיקרואורגניזמים פילמנטריים.

מורפולוגיה מיצלית, למשל, ידועה כבעלת צמיגות גבוהה בהרבה ממורפולוגיה של פלטה. לפיכך, הפרודוקטיביות הכוללת של התהליך נפגעת עקב בעיות בטיהור המוצר המבוקש. מספר המורפולוגיה שלנו יעזור בביסוס מודלים הנוגעים לתרבית, לטופולוגיה, וירחיב את הבנתנו לגבי מורפולוגיה פטרייתית באופן כללי.