באמצעות רצף מעצר SecM ככלי לבודד פוליפפטידים כרוכים הריבוזום

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לבודד קומפלקסים של שרשראות ראשוניות הקשורות לריבוזום 70 s (RNCs), המיוצרים במהלך תרגום במערכת תאי-חופשית (cell-free) במעבדה, באמצעות SEC TED 70. דבר זה מושג תחילה על ידי הוספת רצף עיכוב (stalling sequence) מסוג SEC M באורך 17 חומצות אמינו לקצה ה-C של הגן הנחקר, ושיבוטו במורד הפרומוטור התעתוקי T7. לאחר מכן, ה-mRNA מתעתק באמצעות תגובת תעתוק במעבדה ואז מטוהר.

לאחר מכן, ה-mRNA המטוהר מתורגם במערכת תמצית S 30 של E coli עם חומצות אמינו רדיואקטיביות כדי לסמן את החלבון המסונתז או את הפוליפפטיד העוברי. לבסוף, קומפלקסים של שרשראות עובריות הקשורות לריבוזום Mr.Ed השני מבודלים באמצעות סנטריפוגציה במדרג סוכרוז ופרקציונציה. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות כי שרשראות עובריות קשורות באופן יציב לריבוזום 70 s, באמצעות אנליזה של אלקטרופורזה של ג'ל עבור הפוליפפטידים המסומנים שבודדו מהפרקציות של המדרג.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שימוש ב-mRNA ללא קודון עצירה, הוא שהיא מבטיחה ביעילות גבוהה את היקשרויות שרשרת הפוליפפטיד הצעירה לריבוזום 70 s במהלך התרגום ובשלב הצנטריפוגה העוקב. בנוסף, בניגוד לטכנולוגיית היעדר קודון עצירה, ניתן להשתמש בשיטה זו ביעילות כמעט שווה הן במערכות in vitro והן במערכות in vivo. שיטה זו עשויה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום קיפול חלבונים תרגומי, כגון בשלב מוקדם באיזה מידה במהלך התרגום עשויים להיווצר תוצרי ביניים שונים של קיפול תרגומי, ולסייע בהמשך בניתוח מבנהם באמצעות שיטות מבניות ישירות או עקיפות.

גישות בדיקה וקביעה טכניקה זו יכולה לסייע לנו לפענח את מסלול קיפול החלבון על הריבוזום. בפרוטוקול זה, תיארנו את בידולם של שרשראות נבטות מלאות של bine gamma B crystalline הקשורות לריבוזום 70 s. עם זאת, ניתן להשתמש בטכניקה זו לבידולם של וריאציות של כמעט כל חלבון רצוי.

ניתן לאמץ אסטרטגיה זו גם כדי לבודד שרשראות פוליפפטידים קטועות של derm Es. באופן כללי, מי שאינו מכיר את השיטה עשוי להתקשות בשלב הסרימרגציה במדרג סוכרוז. עם זאת, עבור מי שמנוסה בכך, הדבר לא אמור להוות בעיה. לאחר ניסיונות ראשוניים פחות מוצלחים שכללו שימוש ב-mRNA ללא קודון עצירה, החלטנו להשתמש ברצף עיכוב שני כדי לבודד פוליפפטידים גדילים של gamma B crystalline הקשורים לריבוזום 70S.

הטכניקה המאוחרת יותר לא יכלה להבטיח את יציבותם של ה-RNCs במהלך שלבי סנטריפוגה עוקבים באותה יעילות כמו הטכניקה הכוללת שימוש ברצף עצירה של SECM. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן השלבים הכוללים הכנה של גרדיאנט והפרדה של RNC עשויים להיות קשים ללמידה, והם דורשים רמה מסוימת של מומחיות כדי להבטיח תוצאות הניתנות לשחזור. את הפרוצדורה ידגים סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי לבצע תמלול ותרגום in vitro, התחילו עם גן רצוי המשובט לתוך פלסמיד המבוסס על T7 ו/או SP6 כדי לייצר קומפלקסים של ריבוזום ושרשרת נבטת (ribosome nascent chain complexes) או RNCs.

הארכו את הקצה ה-C של הפוליפפטיד המטרה על ידי הוספת רצף המשרה עצירה (arrest inducing sequence) מ-M, כדי להבטיח שפיסת הפוליפפטיד תבלוט מחוץ לתעלה הריבוסומלית. הוסיפו מקשר (linker) גליצין גמיש בין החלבון לרצף העצירה של SEC M כהכנה לתעתוק in vitro. השתמשו באנזים הגבלה שיחתוך במורד של מסגרת הקריאה הפתוחה (open reading frame) כדי להפוך את ה-DNA התבנית לליניארי. בצעו אלקטרופורזה בג'ל AGOZ כדי לוודא עיכול מלא של הדגימה. לאחר אימות ריכוז ה-DNA האופטימלי, השתמשו בערכה לתעתוק בנצילות גבוהה בהתאם להוראות היצרן כדי לסנתז RNA שליח.

השתמשו בשיקוע באמצעות ליתיום כלוריד כדי לטהר את ה-mRNA. לאחר מכן, הריצו דגימה על ג'ל אקרילמיד או ג'ל agarose כדי לאמת את טוהר החומר. עבור תרגום in vitro.

בשימוש במערכת e coli במים נקיים מנוקלאז, הוסיפו תערובת חומצות אמינו בריכוז 1 mM ללא methionine, 10 יחידות של מעכב ribonuclease, 20 µCi של 35 S methionine, 20 µL של תערובת תגובה, 24 µL של בופר הרכבה ו-24 µL של e coli Lysate. חממו מראש את התגובה על ידי דגירה בטמפרטורה של 30 °C למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסיפו 1 עד 2 µg של mRNA ודגרו למשך 10 עד 15 דקות נוספות בטמפרטורה של 30 °C.

עצרו את התגובה על ידי הנחה על קרח כדי לבודד קומפלקסים של שרשראות בצמיחה הקשורות לריבוזום 70 s או ncs. העבירו את תגובת התרגום מעל 4.5 milliliters של גרדיאנט סוכרוז של 5% עד 30% ב-20 millimolar heaps. Potassium hydroxide pH 7.5, עם 15 millimolar מגנזיום, 100 millimolar פוטסיום אצטט ו-one millimolar DTT. סובבו בצנטריפוגה במהירות של 41,000 RPM למשך שעתיים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, בצעו פרקציונציה של גרדיאנט הסוכרוז באמצעות מערכת גרדיאנט צפיפות תכנונית וגלאי ספיגה המכוון ל-254 nanometers.

אסוף את הפראקציות המכילות ריבוסומי 70 s לצורך ניתוח נוסף כדי לקבוע אם החלבון המוארך SEC M נותר קשור לריבוסום 70 s. השקע את החלבון בכל פראקציית גרדיאנט על ידי הוספת חומצה טריכלוראצטית. הדגר את הדגימות למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C; למחרת, סבב את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של 14,000 ×g למשך 15 דקות כדי לשקיע את החלבון כמשקע (pellet), ושטוף את המשקעים ביחס של 4:1 של אצטון ל-1 mM tris, HCL pH 7.6.

ייבשו את הכופתיות באוויר, ולאחר מכן השעיו אותן שוב בבופר טעינה עבור SDS page. הריצו את הדגימות ב-tris Trice SDS page, לאחר מכן קבעו וייבשו את הג'לים והעבירו אותם לצילום רדיוגרפי אוטומטי (auto radiography) ודימוי זרחני (phospho imaging) כפי שמוצג כאן. בעקבות תרגום in vitro, בודדו את ריבוזומי 70 S באמצעות סנטריפוגציה במדרג סוכרוז ופרקציונציה, כדי להבטיח שחלבון ה-gamma B crystalline נשאר קשור באופן יציב לריבוזום.

הfracions המכילים 70 s אופקו, עברו להסרת מלחים והחלפת בופר, והוכפפו לסבב נוסף של צנטריפוגציה במדרג סוכרוז. התוצאות המוצגות כאן מרמזות כי SEC M יכול להשרות ביעילות עצירה של התרגום ב-RNCs של gamma B crystalline. ברגע שהטכניקה נלמדת, ניתן לבצעה ביום עבודה אחד, למעט ניתוח ג'ל אלקטרופורזה של השֶרשרת המתהווה, הכולל בדרך כלל שלב של שקיעה ב-TCA למשך הלילה.

במהלך ביצוע פרוצדורה זו, קריטי להמנע מזיהום ב-RNAs בכל אחד מהשלבים. זיהום ב-RNAs עלול להשפיע על יעילות התרגום של התמצית ולהוביל לשחרור של פוליפפטיד ראשוני מהריבוזום 70S. בעקבות פרוצדורה זו, ניתן להשיג NAST ופוליפפטידים באורך שנקבע מראש הקשורים באופן יציב לריבוזום 70S, בהתאם למטרה הסופית.

ניתן להשתמש בקומפלקסים אלו למטרות שונות, כגון קביעת הקונפורמציה של שרשראות נבטות (nascent chains) הקשורות לריבוזום באמצעות גישות ישירות ועקיפות כמו NMR או FRET, או לבדיקת קישור של גורמים וליגנדים לאחר פיתוחן. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה המבנית וקיפול חלבונים לחקור את הקונפורמציה של חלבונים באורכם המלא הקשורים לריבוזום, כמו גם תוצרי ביניים של קיפול קו-טרנסלציוני. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן ההכנה והבידוד של פוליפפטיד נבט, הקשור באופן יציב לריבוזום 70 S, שניתן להשתמש בו בהמשך כדי לענות על שאלות שונות בתחום קיפול חלבונים טרנסלציוני.

אין לשכוח כי עבודה עם איזוטופים רדיואקטיביים וחומצות אמינו מסומנות, כגון, למשל, A 35 methionine, דורשת אמצעי זהירות מיוחדים, ויש להביאם תמיד בחשבון בעת ביצוע פרוצדורה זו.