Microfabricated פוסט מערך גלאים (mPADs): גישה לבודד כוחות מכניים

שלום, אני נתן סנייה דקי, ואיתי היום הם וס ליגן, רובי דסאי ומייק יאנג. אנחנו מהמעבדה של כריס צ'ן כאן באוניברסיטת פנסילבניה. בסרטון זה נציג את הגישה שלנו למדידת כוחות משיכה תאיים באמצעות מערך עמודים שיוצר במיקרו-פבריקציה.

כוחות מתיחה נוצרים באמצעות אינטראקציות בין מיוזין לאקטין וממלאים תפקיד חשוב בפיזיולוגיה שלנו. במהלך ההתפתחות, הם מאפשרים לתאים לנוע ממיקום אחד למשנהו כדי להקים את המבנים הראשוניים של הרקמה שלנו. כמו כן, הם מסייעים בתהליך הריפוי, שכן הם נחוצים לסגירת פצעים או לנדידה וזחילה של לוקוציטים בגופנו.

אך למרבה הצער, אותם כוחות עלולים להזיק לבריאותנו במקרה של גרורת סרטן או צמיחה של כלי דם לעבר גידול. לפיכך, קיימות שיטות מעטות מאוד שבאמצעותן ניתן למדוד כוחות מתיחה אלו באופן כמותי, ובמיוחד בקנה מידה מיקרונרגי וננונרגי של תאים בודדים. מרבית השיטות הנפוצות לחקר תאים in vitro התבססו על צלחונות בעלי תחתית זכוכית או צלחונות פוליסטירן, אך אלו הם תסבכים קשיחים מאוד, והם אינם מאפשרים לנו למדוד באופן פיזי את כוחות המתיחה ואת העיוותים שגורם התא.

לכן, היה קשה מאוד להבין את המנגנוסים הבסיסיים של כוחות מתיחה ללא סוג כלשהו של קריאה פיזיקלית. במעבדה של כריס צ'ן, פיתחנו טכניקה המאפשרת לנו להתגבר על מגבלות אלו. השיטה שלנו מבוססת על מערך אנכי של זרועות קפיץ (cantilevers) גמישות, שקשיחותן וקנה המידה שלהן מאפשרים לתאים בודדים להיפרש על פני מספר זרועות ולהסיט אותן בתהליך.

הממדים שבהם אנו משתמשים בשכיחות הגבוהה ביותר הם עמודים גליליים בעيد 3 µm, בגובה 10 µm, עם מרווח של 9 µm ממרכז למרכז ובמערך מלבני. עם זאת, ניתן לשנות ממדים אלה כדי להתאימם למגוון של מחקרים תאיים. אנו מתחילים עם תבנית מאסטר קשיחה מסיליקון שניתן לראות כאן, ולאחר מכן מעבירים אותם לקנטילברים גמישים מ-PDMS שניתן לראות כאן.

באמצעות טכניקה זו אנו יכולים למדוד את העיוותים של קניבליים (cantilevers) בודדים תחת מיקרוסקופ ולגזור מכך את כוחות המתיחה התאיים, כולל העוצמה והכיוון הנדרשים כדי ליצור עיוותים כאלה. הפכנו את התשתיות הללו ל-M pads עבור גלאי מערכי מיקרו-עמודים, ובסרטון זה נראה לכם כיצד לייצר את ה-M pads, החל מהתבנית הראשית (master) מסיליקון, דרך השכפול ב-PDMS, ועד לחישוב המודולציה והמכווצות התאית.

זהו חדר נקי מאבק ורגיש לאור, המאפשר לנו להכין את עמודי ה-SU eight שישמשו כמאסטר הסיליקון. נתחיל עם פרוסית סיליקון, ונצפה אותה בפוטורזיסט SU eight; ה-SU eight הוא רזיסט שלילי והוא רגיש לאור. לכן, כאשר נחשיף את הפרוסית לאור דרך מסכת פוטו זו, האור יצור תבנית של העמודים המיקרוסקופיים ואז יגבש מבנה תלת-ממדי, שיהיו אלו עמודי ה-SU eight שבהם נבצע יציקה של PDMS.

לאחר השלמת כל תהליכי העיבוד, פרוסת הסיליקון תיראה כך, כאשר מבני המיקרו-פילרים (micro pillars) והמיקרו-פוסטים (micro posts) כבר יוצרו בתוך הפרוסה. כדי להכין את התבניות (masters), נתחיל תחילה עם פרוסת סיליקון נקייה, שעברה ניקוי בטיפול באוזון למשך שבע דקות, ובנוסף ייבשנו את הפרוסה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 120 °C. כעת נבצע ציפוי בסבב (spin coating) של SU-8 2002 על הפרוסה כדי ליצור שכבת בסיס דקה מאוד עבור הפוסטים.

מכיוון שאנו עומדים לסובב SU-8, אלבש מסכת גז. טען מחדש את הפרוסה לתוך המחזיק הזה, הסר כל אבק שעשוי להיות עליו, הנח אותה על הספינר, ונבדוק שהיא ממורכזת. לאחר מכן נמשיך למזוג את ה-SU-8 2002 מעל הפרוסה. לאחר מכן נסובב את הפרוסה. לאחר מכן נניח אותן על לוח החימום עבור ה-soft bake.

נבצע זאת למשך דקה אחת לאחר מכן. לאחר מכן, ניקח את הדגימה ונעביר אותה ללוח חימום בטמפרטורה של 95 מעלות. נבצע זאת למשך שתי דקות.

וכשזה יסתיים, ניקח את המצע ונבצע חשיפה רחבה (flood exposure) במכשיר ה-mask aligner. אוקיי, זה עתה ביצענו ספינ-קוטינג של SU-8, השכבה הראשונה של SU-8 על גבי וופר זה, וכעת עלינו לבצע חשיפה רחבה של כל הוופר כדי ליצור את שכבת הבסיס הראשונה עבור המיקרו-פוסטים. לכן, עלינו להעניק למצע חשיפה של 70 millijoules.

כעת עלינו למדוד את העוצמה הממשית של האור במיישר המסכות שלנו. נטען את המד למשקל בתוך מיישר המסכות, ולאחר מכן נחשיפו אותו לאור.

כאן זה אור UV. אנחנו טוענים את פרוסת הסיליקון למכשיר יישור המסכות (mask aligner) וממקמים אותה בתוכו. הפעם אין לנו מסכה, כדי שנוכל לחשוף את כל השכבה.

נסגור את התריס, נכוון לדקת חשיפה אחת ונתחיל בחשיפה. לאחר דקה, כשהמערכת סיימה, נוכל להוציא את הפרוסה. כעת עלינו לבצע את אפיית לאחר-החשיפה.

כעת, לאחר שחשפנו את הפרוסה, אנו נוסיף חום כדי להשריש את תגובת הצמירה (cross-linking) עבור שכבת ה-SU-8 הראשונה. נניח אותה על פלטה חמה בטמפרטורה של 65 °C למשך דקה אחת, ולאחר מכן נעביר אותה לפלטה חמה בטמפרטורה של 95 °C למשך שתי דקות. לאחר תהליך של שתי דקות, נכבה את הפלטה החמה ונמתין עד שהפרוסה תתקרר חזרה לטמפרטורת החדר, תהליך שלוקח כ-30 דקות.

כעת סיבבנו את השכבה השנייה של SU 8 על גבי פרוסת הסיליקון (wafer). כעת עלינו לחשוף אותה באמצעות מסכת הפוטו-ליתוגרפיה. הפעם נשתמש במסנן UV כדי לחסום את קרינת ה-UV העמוקה.

זוהי זכוכית אופטית של Hoya שניתן להשיג, אך הפעם עלינו למדוד שוב את העוצמה. לכן, נשתמש במד האור שלנו או נשתמש במסנן למעלה כדי למדוד את העוצמה שסוננה. לאחר מכן, נטען את המסכה למיישר המסכות (mask aligner).

מתג זה יוצר ואקום המחזיק את המסיכה במקומה. לאחר מכן נניח אותה בתוך מכשיר יישור המסיכות (mask aligner). לאחר מכן נניח את המסנן מעל ונכניס את הפרוסה (wafer).

אנו רוצים לוודא שיש מגע טוב, לכן נרים את המדף עד למגע, ולאחר מכן נתחיל בחשיפה. לאחר החשיפה, נוציא את פרוסת הסיליקון (wafer) ממכונת יישור המסכה (mask aligner). כעת יש לנו אזורים שנחשפו באופן סלקטיבי. נעביר אותה לתנור או לפלטות החימום כדי לבצע אפייה לאחר חשיפה (post-exposure bake).

ביצענו כעת את שלב האפייה הסופית לאחר החשיפה (post-exposure bake), וכעת נפתח את פרוסת הסיליקון (wafer) כדי שנוכל לקבל את המבנים התלת-ממדיים. ננקה ונפתח את הפרוסה ב-PGMEA, שישטוף את ה-SU-8 שלא נחשף. נתחיל בטבלה אחת של PGMEA ונשהה את הפרוסה בתוכה למשך שתי דקות בערבוב עדין.

אני אשאיר זאת למשך שתי דקות. לאחר מכן, נעביר את הדגימה לכלי שני המכיל P-G-M-E-A. פעולה זו תסיר את ה-P-G-M-E-A הרווי ב-SU eight.

לאחר 10 שניות נעביר את הדגימה ל-IPA. פעולה זו שוטפת את ה-P-G-M-E-A. נשאיר את הדגימה שם למשך 20 שניות, שוב עם ערבוב עדין.

כעת יש לנו את מבני העמודים העומדים באופן חופשי. לכן, נכניס אותם להקסאן, שמתאפיין במתיחות פשטית נמוכה. נשטוף למשך חמישה שניות באחד ולאחר מכן בשני מבחנות של הקסאן, ואז נהיה מוכנים לייבש זאת באמצעות נשיבת אוויר.

כעת, לאחר שסיימנו את פיתוח הפרוסה, נניח אותה על פלטה מחוממת ונעלה את הטמפרטורה בהדרגה עד ל-150 °C. טמפרטורה גבוהה זו גורמת לקשירה צולבת נוספת של ה-SU-8 כדי להפוך אותו לקשיח יותר מבחינה מבנית, ונשאיר אותו על הפלטה המחוממת למשך הלילה. מדובר על פרק זמן של 14 עד 20 שעות, ולאחר מכן נכבה את הפלטה המחוממת ונמתין לקירור חזרה לטמפרטורת החדר.

אם כן, מה שעלינו לעשות הוא לחתוך את הפרוסה הזו לגודל קטן יותר. אנו מעוניינים בעצם לחתוך את פרוסת הסיליקון הזו וליצור שבב קטן הכולל רק את התבנית הפנימית הזו. וזה ייראה בערך כמו המבנה שם, שבו יעשו שימוש באפוקסי.

כעת נדביק את השבב על גבי שלייד זכוכית באופן הזה, דבר המספק תמיכה מבנית. חיתוך של וייפר הוא סוג של אמנות, אך מה שניתן לעשות הוא להשתמש בסבון יהלום ולהתחיל מקצה אחד בלבד.

ובשל מישורי הגביש, יוצרים חריץ קטן. כעת נוצר שבר, שניתן להקיש עליו באמצעות הכלי הזה. ניתן לקלף זאת, ולאחר מכן לבצע חיתוכים נוספים עד לקבלת מבנה קטן כזה. לאחר מכן, מניחים במהירות את שבב הסיליקון על הזכוכית ומקבעים אותו במקומו. משאירים זאת להתייצב.

לאחר שתסיימו, יהיה לכם מכשיר הדומה לזה. הצמדנו את תבנית הסיליקון לשקף זכוכית זה, וכעת נחיל עליה ציפוי של floy, שיסייע בשחרור המבנה מה-PDMS בשלב מאוחר יותר. נניח את השבב בתוך הכלי ליישוב (desiccator) ולאחר מכן ניקח מספר טיפות של tri Chloro Siling ונניח אותן בתוך הכלי.

אנו מבצעים זאת בתוך המנדף כיוון שתהליך זה מייצר גז מימן כלורי כתוצר לוואי, אשר הוא חריף למדי. סגרו את המכסה, חברו את המערכת לוואקום ולאחר מכן נשאיר את המערכת תחת ואקום ונפחית את החומר למשך הלילה כדי לקבל ציפוי אחיד על פני כל פרוסת הסיליקון. שלום, אני ווסלי ליגאן.

אני סטודנט לתארים מתקדמים במעבדה של Christopher Chen. בשלב זה, Nate הראה לכם כיצד ליצור תבנית סיליקון (master) עבור תשתיות ה-ED שלנו. עם זאת, לפני שנוכל להשתמש בכלי זה למדידת כיווצות תאית, יש להוסיף שלב של שכפול המבנים הפוטוגרפיים הקשיחים באמצעות פולימר סיליקון אלסטומרי.

המטרה הראשונה שלנו היא לייצר תבנית שלילית של מאסטר הסיליקון שהכנו קודם לכן. אנו עושים זאת באמצעות אלסטומר סיליקון הנקרא PDMS או Polymethylsiloxane. כעת אנו מוסיפים חומר מקשה ביחס של 1 ל-10 לפולימר ה-PDMS שלנו.

לאחר ששקלנו את התמיסה, יש לערבב ביסודיות את פולימר ה-PDMS ואת סוכן הקישור. ערבוב זה מחדיר באופן ברור בועות אוויר רבות לתמיסה שלנו. לכן, בנקודה זו, יש לכסות אותה ולבצע ניקוי גזים (degassing) בתוך דסיקטור ואקום.

לאחר שה-PDMS עבר ניקוי גזים מלא וכל הבועות עלו לפני השטח והתפוצצו, ניתן להוציאו מהדסיקטורor של הוואקום. כעת ניתן להשתמש בתערובת זו של PDMS וסוכן קשירה (cross-linking agent) כדי ליצור תבנית שלילית של המאסטר מסיליקון. כדי לעשות זאת, נשתמש בתבנית פאי ונניח את המאסטר מסיליקון המורכב במרכזה.

לאחר מכן, נשפוך בזהירות את תמיסת הפולימר של ה-DGAs אל תוך הצלחת מעל פרוסת הסיליקון, תוך ניסיון למנוע היווצרות בועות נוספות. בדרך כלל, נשפוך את הפולימר לעובי של כרבע אינץ'. ניתן לראות שתהליך זה מחדיר באופן בלתי נמנע מספר בועות אוויר אל תוך התערובת.

כעת נניח את הצלחת זו בצד למשך כ-30 דקות כדי לאפשר לבועות לעלות לפני השטח ולהתפוצץ. ניתן לראות שלאחר ההמתנה, עדיין נותרו מספר בועות אוויר על פני השטח של ה-PDMS. עם זאת, מכיוון שאלו נמצאות על פני השטח העליון, נוכל כעת להשתמש בזרם קצר של חנקן כדי לפוצץ את כל הבועויות שנותרו.

על מנת להשלים את קשירת הצלובים של תמיסת ה-PDMS וה-CROSSLINKER וליצור תבנית שלילית קשיחה של המאסטר מסיליקון, נחמם אותה בטמפרטורה של 110 degrees Celsius למשך 20 דקות. ניתן לראות שכבה דקה של PDMS מעל תשת הסיליקון. לפני שנוכל להפריד ביניהן, יש להסיר תחילה שכבה זו באמצעות חיתוך.

לאחר מכן, נוכל להרכיב את השכבה העליונה הזו ולקלף אותה בעדינות ממצע הסיליקון. בשלב זה, נוכל להפוך ולקלף באיטיות רבה את מצע הסיליקון השלילי, את מצע ה-PDMS השלילי, מהתבנית המקורית של הסיליקון. אנו עושים זאת על ידי החזקת קצה אחד למטה וקלוף עדין של מצע ה-PDMS.

ניתן לראות את התקדמות החזית בעוד התשתית נקלפת מהתבנית המקורית מסיליקון. כעת, לאחר שיצרנו תבנית שלילית של PDMS מהתבנית המקורית מסיליקון, נוכל לחתוך אותה לארבע תבניות שליליות נפרדות כדי להכין את תשביות הפאד הסופיות. בשלב זה, חשוב לא לגעת בחלק העליון של התשתית השלילית עם פינצטה או עם הכפפות כדי למנוע פגיעה במשטח.

בשלב זה, יצרנו ארבע תבניות שליליות בודדות מהתבנית המאסטר מסיליקון, המורכבת מבארים בקוטר 3 µm ובעומק 9 µm. כדי לשחזר את משטחי הקנטילבר הבולטים, ניתן לבצע יציקה חוזרת על תבניות שליליות אלו באמצעות PDMS של PDI. עם זאת, לפני שנעשה זאת, יש להפוך תחילה את התבניות השליליות לא-דביקות על ידי ציפוי בחומר פלואורו.

אנו מבצעים זאת בתא פלסמה של 100 watt בהספק מלא למשך דקה אחת. לאחר המתנה לריקון התא, נחזיר את הפלסמה; פעולה זו יוצרת שדה גז יוני אשר תוקף (etches) את פני השטח העליונים של ה-PDMS והופך אותם לדביקים יותר עבור מולקולות ה-fluoro Cy Lane. לאחר הוצאת התבניות השליליות מהמייבש בוואקום, ניתן לראות שמה שנותר הוא מערך של בארות בעומק 3 micron על 10 micron בשכבת PDMS שאינה דביקה.

על מנת לשחזר את הקנטילברים האנכיים, המשמשים אותנו עבור תשתיות ה-mpad, יש ליצוק שוב על גבי אלו באמצעות אותה תערובת PDMS, ובכך נקבל מערך חיובי עומד של קנטילברים אלסטומריים, המשקפים באופן זהה את מאסטר הסיליקון שייצרנו קודם לכן. השלב הראשון בהליך זה הוא להעביר את התבניות השליליות הלא-דבקיות אל ג'יג קיבוע שהכנו מרצועות PDMS ועשיו של זכוכית למיקרוסקופ. הסיבה למבנה זה תהיה ברורה בשלב הבא.

בשלב זה, ניתן להניח טיפה קטנה של אותה תערובת PDMS למקשר (crosslinker) ביחס של 10 ל-1, שעברה כבר תהליך Degas, על פני השטח העליון של כל אחת מהתבניות השליליות. דרושה כמות קטנה בלבד של PDMS, כדי שלא תזלג לדפנות של התבניות השליליות. בשלב זה.

על מנת לפרוס את ה-PDMS בצורה מלאה יותר על פני השטח העליון של התבניות, ניתן לתפוס תבנית אחת באמצעות פינצטה, להפוך אותה ולהביאה למגע עם התבנית הסמוכה, תוך כדי פריסה זהירה של ה-PDMS כדי לכסות את כל התשתית באופן מלא. יש להיזהר מאוד בשלב זה כדי לא להחדיר בועות נוספות לתוך תמיסת ה-PDMS העליונה; ניתן לחזור על הפעולה עם שתי הבארים האחרות, שתי התבניות האחרות. כעת, כאשר יש לנו ציפוי PDMS אחיד יותר על פני השטח העליון, ניתן להניח את המתקן במייבש בוואקום (vacuum desiccator) כדי להסיר בועות נוספות שעלולות להיות לכודות בשכבת ה-PDMS שמעל התבניות השליליות.

תהליך זה אורך בדרך כלל כ-30 דקות. בזמן שהתבניות השליליות שלנו עוברות ניקוי בועות (degassing), נוכל לנקות את תתי-הנשבים (substrates) מזכוכית בגודל 22 על 22 מילימטר, אשר ישמשו כמקום העיגון הסופי עבור הרפידות. השלב הראשון בתהליך זה הוא ניקוי חלקיקי אבק באמצעות חנקן דחוס.

נחשוף את כיסויי הזכוכית לפלסמת גז, אשר תבצע שריפה (ash) של הפנימי ותהפוך אותו לדביק יותר עבור ה-PMS, אותו נצמיד אליו בשלב הבא. לאחר המתן של כ-30 דקות להתייבסות שכבת ה-PDMS העליונה ולביצוע הפעלת פלסמה לכיסויי הזכוכית, נוכל להסיר את התבנית ולהביא את פני השטח העליון של כיסויי הזכוכית, שנחשפו לפלסמת הגז, למגע עם שכבת ה-PDMS שמעל התבניות השליליות. בדרך כלל מומלץ להביא קודם את קצה אחד של כיסוי הזכוכית למגע עם ה-PDMS, ולאחר מכן לאפשר לשאר כיסוי הזכוכית להינח ב-SH כך שה-PDMS יתפשט בצורה של שכבה.

פעולה זו מסייעת להפחית בועות אוויר שהוכנסו לסרט ה-PDMS. בשלב זה, ניתן ללחוץ בעדינות על פני השטח העליונים של כיסוי הזכוכית (cover slip) באמצעות הפינצטה כדי לדחוף החוצה עודפי PDMS, וכן כדי להזיז את כיסוי הזכוכית עד להגעה לצלב ה-PDMS במרכז התבנית. פעולה זו תמנע את תזוזת כיסוי הזכוכית בזמן התגבשות ה-PDMS.

נחזור על פעולה זו עבור שאר התשתיות. בשלב זה, ניתן להעביר את התבנית כולה לתנור ולאפות ב-110 °C למשך 22 שעות. לאחר קירור המכלול כולו לטמפרטורת החדר, ניתן להוציא את התשתיות, להפוך אותן ולקלף בזהירות את תבנית השלילה מכיסוי הזכוכית.

חשוב לבצע זאת באיטיות ובאופן אחיד כדי למנוע מעיכה של העמודים או תלישה שלהם ממצע הזכוכית. ניתן לראות שלאחר קילוף תבנית השלילה, נשארנו עם מערך של זרועות קפיציות (cantilevers) המדמה בדיוק את המאסטר מסיליקון, אלא שכעת הן בנויות מאלסטומר PDMS גמיש. ובכן, בשלב זה הדרכנו אתכם כיצד לייצר את המאסטר מסיליקון עבור מצעי ה-Emad שלנו.

לאחר מכן, השתמשנו בתהליך יצירת העתק (replica molding) כדי לייצר העתק מדויק באמצעות פולימר אלסטומרי מסוג A-P-D-M-S, כך שהקנטילברים הם כעת גמישים, מה שמאפשר לתא להתפשט ולהתכווץ ולהסיט את הקנטילברים בתהליך זה. בנקודה זו, התשתיות שלנו מוכנות לעיבוד עבור תרבית תאים. כעת, לאחר שראינו כיצד לייצר ולשכפל תבניות ליצירת ה-EDS, נבצע מספר שלבים נוספים כדי להפוך את ה-EDS לפונקציונלי, כך שנוכל לגדל עליו תאים ולאחר מכן לנתח כוחות מתיחה (traction forces).

אך לפני שנעשה זאת, עלינו לבצע שלושה דברים. עלינו להפוך את קצות העמודים לדביקים עבור תאים. שנית, עלינו לסמן את ה-PDMS באופן פלואורסצנטי כדי לסייע בויזואליזציה ובניתוח שלסטיות העמודים.

ושלישית, עלינו להפוך את דפנות העמודים וכן את בסיסי העמודים לבלתי-דביקים לתאים, כך שכוחות מתיחה יופעלו רק בקצות העמודים. נראה כיצד שלבים אלו מתבצעים באמצעות אסטרטגיה המבוססת על הדפסת מיקרו-מגע (micro contact printing) בדקות הבאות. אך ראשית, השלב הבא הוא ניקוי שאריות של PDMS מהקצוות.

כפי שציינתי, השלב הראשון הוא לקחת את תשת המערך של ה-EDS, שאותה הדגימה וסט והראה לכם כיצד להכין ולגזור. את עודפי ה-PDMS שנוצרו כתוצאה מההב curing של כיסוי הזכוכית מול התבנית השלילית, גזרו באמצעות להב תער חד. את עודפי ה-PDMS מסירים על ידי הנחת להב התער באופן אנכי על התשת בקצה העמודים, ולאחר מכן גרירה של העודפים.

ניתן להשתמש באצבע אחת כדי להחזיק את זכוכית הכיסוי במקומה, כך שהיא לא תזוז. כך נקבל תשתית M pad נקייה משאריות ולכן נגישה בקלות. בשלב הבא, עלינו לבצע הדפסה במיקרו-מגע (micro contact printing) של ה-MPAs כדי להפוך את קצוות העמודים לדביקים.

כדי לעשות זאת, עלינו תחילה להכין חותמות, ותהליך זה הוא פשוט מאוד. אנו פשוט מערבבים PDMS ביחס של 1:30 במקום ביחס של 10:1. אנו מוזגים את התערובת לצלח פטרי כך שגובה ה-PDMS יהיה בקירוב 1 cm.

הניחו לתמיסה להוציא גזים. כלומר, המתינו עד שהבועות יעלו לחלק העליון של ה-PDMS, ואז בצעו את תגובת ההצלבה בתנור בטמפרטורה של 60 °C למשך שעה אחת. לאחר הוצאת הצלחת מהתנור וקירורה, אני מוכן כעת לגזור את החותמות. שוב, באמצעות אותו סוג של להב תער, פשוט גזרו על ידי לחיצה אנכית כלפי מטה אל תוך ה-PDMS עד למגע עם תחתית צלחת הפטרי.

כעת עלינו להקפיד על כיוון החתימה. פני השטח של החתימה הם הצד של ה-PDMS שנוצק כנגד תחתית פטרי התרבית כדי שיישאר שטוח. לכן, בריבוע הגדול של ה-PDMS שגזרתי, פני השטח של החתימה פונים כעת כלפי מעלה.

כעת החותמת גדולה בהרבה מרפי ה-M, לכן אקצץ אותה שוב לגודלו של רפי M בודד באמצעות חיתוך עם להב תער. מכיוון שקשה מאוד לקבוע את הכיוון הנכון של החותמת בעין, אצור חריץ קטן במה שיהיה צד האחור של החותמת, כלומר הצד שאינו הפנים, בדיוק כך. כעת אוכל להסיר את החותמת מהלוח הגדול יותר. ויש לי כעת חותמת A-P-D-M-S לשלב הבא.

עלינו לנקות את חותמי ה-PDMS. מכיוון שייתכן מאוד שאבק מהאוויר שקע על חותמי ה-PDMS בזמן שחתכתי אותם, נבצע תהליך שבו נניח את מספר חותמי ה-PDMS הרצוי בתוך צלחת התגבשות זו ונמלא את הצלחת ב-100% ethanol.

הוסיפו כמות מספקת של ethanol כדי לכסות את פני החותמות, אך הכמות המדויקת של ה-ethanol שנוספה אינה קריטית. לאחר מכן, הניחו את דיסק ההתגבשות בתוך מקפיר (ator) ובצעו סוניקציה לחותמות למשך חמש דקות. עם סיום חמש הדקות, נסיים את עיקר, החותמות ונבצע את שאר תהליך ההדפסה במיקרו-מגע (micro contact printing), שהוא פונקציונליזציה של פדי ה-M, בתוך מ !='')מבת תרביית רקמות סטרילית.

כעת אנו נמצאים במabilis תרביות רקמות, שבו נוכל להשלים את עיקור החותמות. לשם כך, נוציא את החותמות מכלי ההתגבשות, נטבול אותן בכלי מלא באתנול כדי לשטוף שאריות פסולת, ולבסוף נטבול אותן בכלי עם מים כדי לשטוף את האתנול. לאחר מכן, באמצעות זרם חנקן, ניייבש את החותמות עד שלא יישארו טיפות נראות לעין.

בשלב הבא, עלינו להוסיף דיו לחותמות באמצעות תמיסת חלבון. תמיסת החלבון שבה אנו משתמשים היא 50 µg/mL של fibrin במים מסוג DEI. פשוט שאבו מעט מתמיסת החלבון באמצעות פיפט והניחו טיפות של תמיסת החלבון על פני השטח של החותמת.

יש לבצע זאת על ידי הנחת טיפות קטנות על קצה פני החותמת. ראשית, חזרו על פעולה זו עבור כל החותמות שבהן תשתמשו; יש לבצע זאת מראש. השלב הבא, לאחר הנחת הנקודות על קצות כל החותמות, הוא לחבר את הטיפות הללו ולמלא את פני החותמת בתמיסת החלבון.

הסיבה שביצענו זאת היא שפתרון החלבון בטיפות וסביבן הופך את פני השטח של החותמת להידרופיליים, מה שמקל על פיזור חלבון המטריצה החוץ-תאית. לכן, חזרו על פעולה זו עבור כל החותמות שאתם משתמשים בהן. כעת, לאחר שפיזרנו את פתרון החלבון על פני החותמות, השלב האחרון בדיוור החותמות הוא לוודא שהקצוות מכוסים. כדי לעשות זאת, פשוט נטה פפיט והריצו אותה לאורך פני החותמת כך שתיצרו מגע הן עם פינת חותמת ה-PDMS והן עם פתרון החלבון.

שוב, חזרו על פעולה זו עבור כל הקצוות של כל החותמות שאתם דיווקים. כעת, לאחר שסיימנו את דיווק החותמות, אנו מניחים אותן ומשאירים את החותמות במנדף לתרביות רקמה למשך שעה אחת כדי להקל על ספיגה מלאה של החלבון על פני החותמת. כעת, לאחר שהמתנו שעה אחת לספיגת החלבונים על פני השטח של החותמת, הגיע הזמן לשטוף אותן במים ולייבשן בעזרת זרם חנקן.

כדי לבצע זאת, ניקח מים סטריליים ונשפו אותם אל הצלחית המכילה את החותמות. יש להיזהר לא לשפוך את המים ישירות על פני החותמה, ובמידת הצורך ניתן להשתמש בפיפטה. הכמות המדויקת של המים אינה חשובה, כל עוד מפלס המים יעלה מעל תמיסת החלבון.

לאחר מכן, בעזרת פינצטה סטרילית, קחו חותמת אחת, טבלו אותה בכלי חדש עם מים וייבשו אותה בעדינות בעזרת חנקן. שוב, תדעו שהיא יבשה כאשר לא תראו יותר טיפות של תמיסת חלבון על החותמת. חזרו על פעולה זו עבור כל החותמות שאתם מעבדים אחת אחת.

כעת, לאחר ששטפנו את החותמות וייבשנו אותן, הגיע הזמן להפעיל את תשתיות ה-mpad על ידי טיפול ב-UV ozone. למשך שבע דקות, אני מסיר את מכסה צלחת הפטרי מעל הצלחת. מכיוון שפוליסטירן סופג UV, אני מניח את הצלחת במכשיר ה-UV ozone, סוגר את המגירה, מגדיר את הזמן לשבע דקות ומפעיל את המכשיר.

כעת חזרנו למכסה של תרבית הרקמות והגיע הזמן להחתים את תשבתי ה-mpad, שטופלו זה עתה באוזון UV. כדי לעשות זאת, הרימו את החותמות שנשטפו ויובשו באמצעות פינצטה. ניתן להחזיק את החותמות מהצדדים, אך אין לגעת בפני החותמת.

יש לכוונן את החותמת בפינצטה כך שצד החלבון יהיה נגיש. לאחר מכן, הפוך את הפינצטה, תוך לשים לב שצד החלבון פונה כלפי מטה, והבא את החותמת במגע איטי עם ה-eds. החותמות הראשונות עד ה-30 הן דביקות למדי, לכן ייתכן שתצטרך להשתמש בזוג פינצטות שני כדי לשחרר את החותמת מהפינצטה.

ניתן להפיל את החותמת מגובה של כ-2 מילימטרים עד כ-8 מילימטרים על ה-emeds. לאחר מכן, הטו את צלחת ה-emeds למעלה ולחצו בעדינות בעזרת פינצטה כדי ליצור מגע בין החותמת לבין ה-eds. תוכלו לדעת מתי נוצר מגע באחת משתי דרכים.

הדרך הראשונה היא לבחון את פני השטח של ה-ED דרך דופן החותמת. ייתכן שיהיה קשה לראות זאת במצלמה, אך בעין ניתן לראות בבירור שהחותמת באה במגע עם פני השטח על ידי התבוננות במשטח דרך דופן החותמת. הדרך השנייה להבטיח מגע היא להוציא את פטרית הפטרי עם המכסה סגור מתוך מנדף תרביות הרקמה ולבחון אותה תחת מיקרוסקופ הפוך.

באמצעות ויזואליזציה של תבניות התאבכות בעזרת המיקרוסקופ, תוכלו לזהות אם ומתי החותמת באה במגע עם המצע. ברגע שקבעתם כי נוצר מגע, החותמת צריכה להישאר במגע עם מצע ה-ed למשך מספר שניות בלבד. כעת הגיע הזמן להסיר את החותמת.

כדי לעשות זאת, קפלו את ה-Eds כלפי מטה באמצעות זוג פינצטות ובפעולה אחת חלקה, קלפו את הבול. הקפידו לעקוב אחרי אילו eds חתמתם ואילו בולים כבר השתמשתם קודם לכן. חזרו על הליך זה פעם אחת לכל EMPA עבור כל מצע שברצונכם להשתמש בו.

כעת, לאחר שהטבענו את ה-EMPAs, השלב הבא הוא לעקר אותם ולאחר מכן לדגרה אותם בצבע ליפופי הנקרא dye eye. Dye הוא מולקולה ליפופית המסומנת פלואורסצנטית, ולכן היא מפעפעת אל תוך ה-PDMS לאורך זמן, מה שמאפשר לנו להדמות את העיוותים של העמודים תחת המיקרוסקופ. לכן, מה שאעשה הוא לקחת כל מצע EMPA בנפרד, אחד אחרי השני, ולהטבילו ב-100% ethanol, 70% ethanol, DI water, DI water, DI water, DI water.

ולבסוף, תמיסה של 5 µg/ml של dii. תמיסת ה-DII היא פלואורסצנטית, ולכן כדי לצמצם את חשיפתה לאור הסביבה ולמזער את הפיגמנטציה הפוטוכימית (photo bleaching) שלה, אנו מכסים את הצלחות בנייר אלומיניום בזמן שהן מדגירות במנדף לתרביות רקמה למשך שעה אחת. כעת, לאחר שהמתנו שעה אחת לדגירה של ה-EM pads בתמיסת ה-DAI, ניתן להסיר את נייר האלומיניום ולשטוף את תמיסת ה-DAI.

אנו שוטחים את הרכיב על ידי שלוש טבילות רצופות במים סטריליים, ולבסוף, אנו טובלים אותו בתמיסה של 0.2%onic F 27. זהו ריכוז של 0.2% משקל לנפח. במהלך כל שלבי הטבילה, חשוב לצמצם את הזמן שבו פדי ה-EM חשופים לאוויר. זאת כדי למנוע נזק למסביבי ה-ED, ובמיוחד כדי למנוע מקטבים שניים לקרוס זה על זה.

Pluronic F1 27 בריכוז 0.2% הוא קופולימר בעל שלושה בלוקים (tri block copolymer) המורכב מדומיינים הידרופיליים והידרופוביים. הדומיין ההידרופילי ידוע כעמיד לספיחת חלבונים ולכן למניעת היצמדות תאים, בעוד שהדומיין ההידרופובי נקשר ל-PDMS ההידרופובי. לפיכך, כאשר PDMS מיהשרה ב-F1 27, ה-F1 27 נקשר ל-PDMS ודוחה היצמדות תאים.

לאחר שעה אחת של דגירה ב-F1 27 כרוני בתוך צלחת פטרי מכוסה בנייר אלומיניום, ניתן לשטוף את ה-F1 27 באמצעות טבילות רצופות במים סטריליים, מים סטריליים ו-PBS. לאחר הטבילה ב-PBS ושטיפת המוצר F1 27, ניתן להטביל את תשתי ה-eds בתמיסת תרבית תאים לבחירה. תמיסת תרבית התאים שבה טבלתי כעת את ה-EMPAs יכולה להכיל סרום ו/או גורמי גדילה אחרים ו/או תוספים כגון penicillin ו-streptomycin.

כל הרכיבים הללו תואמים לחלוטין לטיפולי ה-EMPAs. כעת, השלב הבא, לאחר שה-eds הושרו בתמיסת תרבית תאים, הוא זריעת התאים הנבחרים על ה-eds. עבור מערך ניסיוני זה במיוחד, אזרע תאי אנדותל מעורק ריאתי בקר (bovine pulmonary aortic endothelial cells) לשלוש צלחות שונות.

הסיבה לכך שאני משתמש בשלוש צלחונות שונים היא שאטפל בשני מהצלחונות במעכבי מגע ידועים, כדי לעכב את התכופפות העמודים, כפי שנוכל לבחון בשלב מאוחר יותר. כדי לזרוע את התאים, אני פשוט לוקח את תרחיף התאים שלי, שואב את הכמות המתאימה למשפ leyendo ואז מטפטף לכל צלחון. אני מוסיף מספיק תאים כך שכאשר אבצע את הבדיקה למדידת כוחות משיכה, התאים יופיעו כתאים בודדים על המצעים.

הכמות שתוסיפו תהיה תלויה בשטח הפריסה וכן בקצב הצמיחה של התאים הספציפיים שלכם. בדרך כלל אנו זורעים בין 1500 ל-5,000 תאים לסנטימטר רבוע של תשתית. לאחר סיום זריעת התאים או הוספת תסמיך התאים בטיפות לתרבית, נערערו את התרבית בעדינות קדימה ואחורה מספר פעמים בכיוונים מאונכים כדי לערבב את תסמיך התאים בתוך צלח התרבית.

חזור על תהליך זה עבור כל המצעים שבהם אתם משתמשים. מיד לאחר זריעת התאים, מקם אותם באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C וברמה מתאימה של פחמן דו-חמצני כדי לווסת את ה-pH ואת מצע גידול התאים. כשעתיים לאחר זריעת התאים, מומלץ לשטוף את התאים על ידי העברת המצעים מכלי תרבית אחד של מצע למצע טרי של אותו מצע גידול תאים.

הסיבה לשטיפה זו היא שמרבית התאים יחלו להיפרש ויגיעו כמעט לשטח הפריסה הסופי שלהם תוך שעתיים. על ידי שטיפת התאים והמצעים, אתם מסירים תאים צפים מתוך מצע תרבית התאים. באופן זה, רק תאים שנצמדו ל-EDS והחלו בתהליך הפריסה יופיעו בבדיקה הסופית של כוחות מתיחה.

בדיקה אחת שניתן לבצע עם תאים שגודלו על MPAs היא דימות בשיטת time-lapse כדי לבחון כמותית את הדינמיקה של הכיווץ התאי. בפרט, הדינמיקה של הכיווץ התאי בתגובה לגורמים מסיסים היא מעניינת. ידוע כי גורמים מסיסים, כגון תרכובות ביולוגיות ותרכובות סינתטיות, מעלים, מפחיתים או בעלי השפעות לא ידועות על הכיווץ התאי.

עבור ניסוי תאי חיים זה, נשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנציה אפי-הפוך זה. על משטח המיקרוסקופ, חיברתי תיבת דגירה קטנה לווסת תרמי כדי לשמור על טמפרטורה של 37 °C עם 5% CO2. נבצע דימות בהגדלה גבוהה באמצעות עדשה אובייקטיבית 60 x plan APO.

כעת נכין את תשתית ההשפעה לצורך הדמיה. לעדשה עם הגדלה של 60x שבה אנו משתמשים להדמיה יש מרחק עבודה של 200 microns, שהוא דק בהרבה מעוביה של צלחת תרבית הרקמה שבה זרענו את התאים קודם לכן. לכן, איננו יכולים להדמות תאים על השתלים בתוך צלחת תרבית הרקמה.

כדי לעקוף בעיה זו, אנו משתמשים בצלחות עם תחתית זכוכית. כעת אעביר את התשתית לתוך צלחת התחתית הזכוכית כשהיא הפוכה, כך שהתאים וקצות העמודים יהיו בממשק של תחתית הזכוכית של הצלחת. לפיכך, כאשר הצלחת מונחת על המיקרוסקופ, מרחק העבודה בין התאים לעדשה הוא פחות מ-200 microns.

כעת אנו מוכנים להניח את הדגימה תחת המיקרוסקופ לצורך הדמיה. כעת אפתח את תא הדגירה לתאים חיים, אכניס פנימה את הדגימה ואסגור את מכסה תא הדגירה. בשלב זה, אסרוק את התשתה כדי למצוא תא מתאים.

לצילום. הדרך היעילה ביותר לעשות זאת היא להשתמש בעדישת 10x עם ניגוד פאזה (phase contrast), שתאפשר לי לראות שטח רחב יותר של התשתית ולמצוא תא במהירות רבה יותר. הקריטריון שלי לבחירת תא מתאים הוא תא בודד.

התא לא צריך להיות במגע עם תאים סמוכים, וגודלו צריך להיות ממוצע בהשוואה לכל שאר התאים על התשתית; מצאתי תא מתאים לבדיקה. הפעולה הבאה שתבוצע היא החלפת העדשה לעדשת 60x כדי לבחון את התא בהגדלה גבוהה. לשם כך, נבצע דפוקוס לעדשה כדי למנוע התנגשות עם הבמה במהלך הסיבוב.

במהלך סיבוב התערת, פתח את התא, סובב חלקית את עדשת ה-60 x; עדשת ה-60 x היא עדשת טבילה בשמן, לכן עלינו להניח טיפה של שמן טבילה על עדשת העדשה. כעת נסיים את סיבוב התערת כדי להביא את עדשת ה-60 x למקומה. נסגור את תא האינקובטור ונכוון מחדש את העדשה כדי להחזיר את התא למיקוד.

לאחר שאכוון את המיקום והפוקוס של התא, אעבור למצלמת ה-CCD כדי לצפות בתא על מסך המחשב ולאחר מכן אתחיל בצילום ה-time-lapse. בניסוי זה, אאסוף תמונות פאזה ותמונות פלואורסצנציה במרווח של דקה אחת. כעת צילום ה-time-lapse התחיל, ואני אשאיר אותו פועל למשך 10 דקות או 10 פריימים, ובנקודה זו אוסיף סרום. כעת חלפו 10 דקות. בשלב זה, אפתח את התא ואוסיף סרום לצלוחית כדי לעורר התכווצות בתא.

הטיימר עדיין פועל, לכן עליי להיות מהיר בביצוע הפעולה הזו. כעת, נמשיך בדימוי התא למשך 30 דקות כדי לעקוב אחר שינויים בכושר ההתכווצות. לאחר סיום דימוי ה-time lapse, ניתן לרצף את התמונות לסרטון כפי שמוצג. להלן שני סרטונים של תמונות הפאזה והפלואורסצנציה.

משמאל מופיע סרטון בניגודיות מופע (phase) של תא שקוף ברובו, המקף בקו שחור. התא פרוס על קצותיהם של 20 עמודי תמיכה, שהם המבנים המעגליים המסודרים בסריג מלבני. מימין מופיע סרטון פלואורסצנציה של אותו התא, אך רק עמודי התמיכה נראים בו.

בה再生 של סרטונים אלה, ניתן לראות שהעמודים המחוברים לתא הם בתחילה חלשים, מוסטים, וסוטים במידה מועטה בלבד מהסריג המלבני. לקראת אמצע הסרטון, הוספתי סרום למצע. הסרום מעורר את התא להגביר את יכולת התכווצותו.

ככל שהתא מפעיל כוחות מתיחה חזקים יותר על העמודים שמתחתיו, העמודים לאורך היקף התא מתחילים להתרחק פנימה. בסרטון הפלואורסצנטי, ניתן לראות כעת כי העמודים סוטים באופן משמעותי ממיקומם בסריג המלבני. כפי שאתאר בהמשך, ניתן להשתמש בהעתקה של מיקומי העמודים הללו בתמונות כדי לנתח את כוחות המתיחה של תא זה.

בעבר ראינו כיצד הכנו את מצעי ה-mpad וכיצד ביצענו להם פונקציונליזציה על מנת לגדל תאים. כעת שמתם לב שהנחתי את מצעי ה-mpad המוכנים לשלוש צלחות תרבית תאים שונות. התאים גדלו במהלך הלילה, וכעת אני עומד לטפל בכל צלחת תרבית תאים בנפרד באמצעות סוכן מסיס שונה, המודולט את כושר הכיווץ באופן ידוע.

כעת ניתן למדוד באופן כמותי את כוחות המתיחה שנוצרו לאחר קיבוע התאים למשך 30 דקות. לאחר הוספת הגורמים המסיחים ומרק 30 דקות לאחר הוספת מעכבי כיווץ, הגיע הזמן לקבע את התאים באמצעות פאראפורמאלדהיד כדי להקפיא את המצב הנוכחי של כוחות המתיחה. לשם כך, חשוב להשתמש בפאראפורמאלדהיד המכיל סידן ומגנזיום, ואנו משתמשים בפאראפורמאלדהיד בריכוז נפחי של 3.7%. שיטת טבילת התשתיות בפאראפורמאלדהיד זהה לשיטת טבילת התשתיות ב-RINs השונים במהלך הפונקציונליזציה.

כלומר, חשוב שלא לתת לתשתיות להתייבש, שכן הדבר עלול להוביל לקריסה מאוחרת. לאחר העברת התשתיות, אני מניח אותן לדגירה ב-paraformaldehyde למשך 20 דקות. בתום 20 הדקות, אנו מוציאים את התשתיות מה-paraformaldehyde, וכעת, לאחר שהתאים קובעו, ניתן להכין את הדגימות לצביעה אימונולוגית סטנדרטית.

לשם כך, נניח את התשתיות כשהן פונות כלפי מעלה על משטח עבודה ונטפטף כמות מספקת של PBS כדי לכסות את התשתית ולהבטיח שהיא תישאר מתחת ל-PBS. לאחר מכן, נשטוף את התשתית שלוש פעמים ב-PBS כדי להסיר שאריות של פאראפורמאלדהיד שעלולות להישאר בתרבית. לאחר שטיפת התשתית שלוש פעמים ב-PBS, ניתן להעביר אותה לשלבי צביעה אימונוהיסטוכימית בהמשך.

אנו מבצעים זאת על ידי תפיסת התשתית באמצעות פינצטה והפיכתה בשלב הראשון של הצביעה האימונוהיסטוכימית, והוא שלב חומר החדירה. במקרה זה, אנו משתמשים ב-0.2% Triton X ב-PBS. עם זאת, המשתמש יכול להשתמש בכל חומר חדירה המתאים ביותר לצרכיו.

אנו חוזרים על פעולה זו עבור כל התשתיות שלנו, וכך אנו מטפלים בתשתיות במהלך תהליך הצביעה האימונוהיסטוכימית. לאחר הצביעה האימונוהיסטוכימית, התשתיות מורכבות על גבי זכוכית רגילה בגודל של אינץ' אחד על שלושה אינץ', אותה ניתן לעבד בכל מיקרוסקופ פלואורסצנציה אפי, בין אם הוא הפוך ובין אם הוא זקוף. על ידי עיבוד הדגימות במיקרוסקופ קונפוקלי, אנו יכולים להתמקד בחלק התחתון של העמודים כדי לקבל את המיקומים שאינם מוסטים, כלומר את נקודות האפס.

לאחר מכן נוכל למקד את המיקרוסקופ עד לקצות העמודים, לצלם תמונה נוספת של העמודים, ועל ידי השוואה בין התמונה העליונה לתחתונה, נוכל למדוד את העיוותים של העמודים ולחשב את כוחות המתיחה שהתאים ייצרו כדי להביא לעיוותים אלו. על ידי ביצוע תהליך זה עבור תאים רבים תחת מספר תנאים שונים, נוכל להשוות את כוחות המתיחה שנוצרו בתנאים השונים. כעת, לאחר שאספנו תמונות של תאים חיים ושל תאים מקובעים, המשימה הבאה שלנו היא למדוד את העיוות ואת כוחות המתיחה בתאים.

כדי לבצע זאת, כתבנו תוכנת מחשב ב-matlab. אלו הן שלוש התמונות שבהן נשתמש בניתוח זה. התמונה הראשונה היא תמונת פאזה של התא.

הדבר מסייע בזיהוי מיקום התא. התמונה השנייה היא תמונה פלואורסצנטית של ראשי העמודים. אנו משתמשים בתמונה זו כדי לאתר את מיקומי העמודים בקצותיהם.

כפי שניתן לראות, חלק מעמודי התמיכה הללו מוטים וסוטים מהסריג המלבני שבו ממוקמים רוב העמודים, כמו למשל עמוד זה. ועמוד זה. התמונה השלישית שבה נשתמש היא תמונת הבסיס, הלוכדת את מיקום העמודים במישור מוקד החוצה דרך בסיסם.

בשלב זה, הן העמודים שהוסטו והן העמודים שלא הוסטו צריכים להיות במצב המנוחה שלהם, במצבם הבלתי מוסט. בסבכה המלבנית, ניתן לראות כי העמודים שהוסטו בתמונה השנייה בבסיסם נמצאים כעת בעמדת ה-FL שלהם. תמונה זו משמשת למציאת המיקום של העמוד במצבו הבלתי מוסט.

בשלב הבא נטען את תוכנית MATLAB, שתבקש מאיתנו לטעון את שלוש התמונות הללו. תנו שם לקובץ. אתם רואים את תמונת המופע (phase image).

נסרט מסגרת סביב האזור המציין היכן נמצא התא, כדי שהתוכנה תדע אילו עמודים לנתח. לאחר מכן, התוכנה מבצעת תיקון עוצמה, סף (thresholding) ונורמליזציה של התמונה הגזוזה כדי לקבוע את קואורדינטות ה-OID של העמודים. משמאל מוצגות תמונות מנורמליזות של עמודים מהתמונה העליונה, ומימין תמונות מנורמליזות של אותם העמודים מהתמונה התחתונה.

לאחר קבלת העמודים וקואורדינטות ה-OID, התוכנית יכולה לקבוע את וקטורי ההעתקה בין הקצה לבסיס של כל עמוד. ניתן להמיר וקטורי העתקה אלו לוקטורי כוח על ידי הכפלתם בקבוע הקפיץ של העמוד. ניתן לנתח כוחות תאיים אלו במספר דרכים, כגון כוח ממוצע לתא או כוח ממוצע לעמוד.

תוצאה שימושית אחת היא תרשים חיצים (quiver plot) שבאמצעותו ניתן להמחיש את ההתפלגות המרחבית של הכוחות. זהו התא שניתחנו כעת, וניתן לראות שהנחתי חצים צהובים על העמודים, אשר תואמים את גודל הכוח ומצביעים לכיוון הכוח. על ידי חזרה על תהליך ניתוח התמונה עבור רצפי תמונות, כגון אלו הדרושים לסרט ה-time lapse שלנו, נוכל להפיק רצף זמני.

הנה סרטון של התא שגיגרנו באמצעות סרום. כפי שניתן לראות, מיד עם הוספת הסרום, התא הגביר את יכולת התכווצותו והטה את העמודים אף יותר. בנוסף, אנו יכולים לכמת כוחות עבור מספר רב יותר של תאים שהוכפפו לתנאים שונים ולאחר מכן קובעו ונצבעו, כפי שמוצג בתרשימי הרעידה (quiver plots) המראים תא שטופל בתרכובת בקרה לעומת תאים שטופלו במעכבי התכווצות.

כפי שניתן לראות, וקטורי הכוח הפועלים על התא במקרה הביקורת הם ארוכים יותר בערכם מאשר וקטורי הכוח בשני המקרים שבהם נעשה שימוש במעכבי התכווצות. כיסינו כאן חומר רב כדי לתאר את התשתית מהמיקרו-פבריקציה, דרך הכנת הדגימה, הניסוי והניתוח, וזאת כדי להדגים את הרב-גוניות של תשתיות אלו.

תיארנו שתי בדיקות שונות, דימוי תאים חיים ובדיקת דגימות מקובעות, וביצענו ניתוח של תאים שהתקבלו משתי הבדיקות הללו והצגנו תרשימי וקטורים (quiver plots) וסרטוני וקטורים. באמצעות כלי עוצמתי זה, ניתן לבצע מגוון של ניתוחים מרחביים וזמניים של כיווצות תאים. כפי שראיתם, שיטה זו נשענת על דיסציפלינות רבות ושונות, כולל מיקרו-פבריקציה, ביולוגיה בסיסית של התא, מדע המשטחים, ניתוח ועיבוד תמונות ורבות אחרות.

ובדיוק כיוון ששיטה זו מבוססת על מספר טכניקות הנדסיות שונות, ניתן להתאים את הפרמטרים, כגון גיאומטריית העמודים, הגורמים המסיסים המושרים ושיטות לניתוח השפעת העמודים (post deflections), בהתאם לצרכי המשתמש. אנו מקווים כי ההדגמה הוויזואלית של שיטה זו, שסקרנו ב-20 עד 30 הדקות האחרונות, תשמש כנקודת מוצא לניתוחים אחרים ומעמיקים יותר של הרגולציה, ההשלכות התפקודיות והיווצרות כוחות משיכה תאיים.