אוסף פרוטוקול לבלב אנוש

המטרה הכללית של הליך זה היא לבצע נתיחה של הלבלב האנושי באופן השומר על האוריינטציה האנטומית. הדבר מושג על ידי הסרת התריסריון והטחול מהלבלב, ולאחר מכן פינוי שומן וכלי דם עודפים מהלבלב. השלב השני הוא צביעת המשטח הקדמי בדיו כחול והמשטח האחורי בדיו שחור.

בשלב הבא, הלבלב מחולק לשלושה אזורים. כל אזור נחתוך לאחר מכן במקטעים רוחביים לפרוסות שוות ומונח בתוך קסטות פאראפין, תבניות OCT, או קצוץ עוד יותר ומונח בתוך מבחנות. לבסוף, נדגמים דגימות מכל שלושת האזורים של הלבלב, תוך שמירה על האוריינטציה האנטומית הנכונה לצורך ניתוח עתידי.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח במחקר על סוכרת מסוג 1, כגון המנגנונים העומדים בבסיס האובדן של מסת תאי בטא, או תפקודם, ואופיים של התקפות תאי מערכת החיסון. הדגמה חזותית של שיטת עיבוד הלבלב היא קריטית, שכן שמירה על האוריינטציה של הלבלב כפי שהייתה in vivo דורשת תשומת לב לפרטים. את הפרוצדורה ידגימו לינדה סניידר, טכנולוגית היסטולוגית, ואמילי מונטגומרי, מדענית ביולוגית במעבדתי.

התחילו בהכנת כל החומרים הדרושים לפרוצדורה. ראשית, סמנו את הקסטות שיכילו את בלוקי הפראפין עם מזהה התורם, סוג הדגימה, מספר האליקוואוט וכל מידע נוסף. לאחר מכן, סמנו את תבניות ה-OCT באופן דומה.

גזרו מספיק חתיכות של נייר אלומיניום כדי לעטוף כל בלוק OCT והניחו אותן בצד לשימוש מאוחר יותר. הכינו את כל המבחנות הדרושות לאחסון הדגימות הטריות והקפואות. הוסיפו RNA later ומצע RPMI לפי הצורך.

בשלב הבא, הכינו את אזורי העבודה, והניחו לוחות ניתוח, מכשירים סטריליים וכל שאר הציוד הדרוש לפרוצדורה הן בתוך מנדף בטיחות ביולוגית והן על משטח העבודה. סדרו את כל הקסטות ותבניות ה-OCT לפי סדר השימוש, במקום נגיש. הכינו אמבט הקפאה על ידי הוספת isop pentane בכמות מספיקה כדי לכסות את הקרח היבש בתחתית של קופסת פוליסטירן.

כדי להתחיל בנתיחה, הסירו את התריסריון ואת הטחול. התחילו בהפרדת התריסריון והלבלב מקצה אחד, והמשיכו עד להפרדה מלאה. הטחול מחובר באופן רופף וניתן להסירו בקלות מהשומן ומהלבלב.

בשלב הבא, נקו את הלבלב משומן מיותר, כלי דם ועצבים באמצעות שילוב של דיסקציה קהה וחדה. הניחו בצד את השומן ואת קשרי הלימפה לעיבוד מאוחר יותר. לאחר הניקוי, הניחו את הלבלב על לוח דיסקציה המכוסה בנייר סופג.

שמירה על האוריינטציה הנכונה של הלבלב היא ההיבט הקשה ביותר בפרוצדורה זו. כדי להבטיח הצלחה, צובעים את המשטחים הקדמי והאחורי בדיו בצבעים שונים. טבלו מקל עם טיפ cotton-tipped בדיו כחול, מרחו את הדיו על המשטח הקדמי של הלבלב וספגו את העודפים.

לאחר מכן, טבול אפליקטור חדש בדיו שחור ומרח אותו על פני השטח האחוריים של הלבלב. החזר את הלבלב למנחו הרגיל. כאשר פני השטח הקדמיים פונים כלפי מעלה, הלבלב מוכן כעת לחיתוך לשלושה חלקים.

ראשית, חיתכו את החיבור בין הראש לגוף. לאחר מכן, חלקו את החלק הנותר למקטעים שווים בקירוב כדי להפריד בין הגוף לזנב, ורשמו את משקלו של כל אזור בלבלב. התחילו במקטע הראש.

חלקו כל אזור למקטעים של כ-0.5 סנטימטר על ידי חיתוך בצורה רוחבית, בדומה לחיתוך כיכר לחם. לאחר שכל אזור בלבלב נחתך, הסירו את המקטע האחרון של אזור הראש, שהוא מקטע נקודת החיבור בין הראש לגוף, והניחו אותו על לוח ניתוח נפרד. קצצו מקטע זה לחתיכות קטנות וחלקו את החתיכות באופן שווה בין מבחנות קריו מסומנות, עם ובלי RNA.

בהמשך, המבחנות יוקפאו. יש לפעול לפי הפרוטוקולים הסטנדרטיים. חזר על הליך זה עבור אזור החיבור בין הגוף לזנב.

לאחר איסוף הדגימות הגרוסות, הטה את כל החתכים הרוחביים ימינה. חתכים לסירוגין מכל אזור יוסרו. עבור בלוקים של פאראפין ו-OCT, הסר את החתך הראשון עבור חסימת פאראפין.

אם חלק גדול מדי, חתכו אותו לחצי. סמנו את הקסטות כ-A ו-B. אם החלק עדיין גדול מדי, חתכו כל חלק בניצב לחתך הקודם, ולאחר מכן סמנו את הקסטות A עד D באופן סיבובי עם כיוון השעון. כפי שניתן לראות כאן, מקמו את הקסטה כך שהתווית תהיה משמאל.

בשלב הבא, מקמו את הרקמה בתוך הקסטה וסגרו את המכסה. העבירו את הקסטה למכל containing neutral buffered formalin. מספרו את הבלוקים ברצף בתוך כל אזור, כאשר תתחילו מהחתך המדיאלי ביותר עבור בלוקים של OCT.

שפכו שכבה דקה של מצע OCT לתוך תבנית מסומנת מראש. לפני הכנסת הרקמה, כסו את הרקמה במצע OCT והקפיאו במהירות את הדגימה לשימוש מאוחר יותר, תוך חזרה לרקמה שהופרשה קודם לכן. בודדו את קשרי הלימפה הלבלביים על ידי הסרת השומן והרקמה החיבורית המקיפה את קפסולת הקשרית. הניחו את הקשריות בתוך כלי סטרילי המכיל DMEF וקצצו קשריות גדולות לחלקים שגודלם אינו עולה על 0.5 סנטימטרים.

לאחר בידוד קשרי הלימפה הלבלביים, חלק את הרקמה בין המבחנות והקסטות שהוכנו לעיבוד המשך. לאחר סיום הטיפול בקשרי הלימפה, קצץ את הטחול ואחסן אותו באופן דומה. לעיבוד התריסריון, השתמש ברפידה גזה לחה כדי לנקות את הרירית מהריר, גזור את הרירית ולאחר מכן חתוך אותה למקטעים.

חלקו את דגימות הרירית כפי שהודגם קודם לכן. באמצעות הליך זה, נאספות דגימות מייצגות מכל אזור בלבלב כפי שניתן לראות כאן. המשקלים של אזורי הראש, הגוף והזנב היו שווים בקירוב.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה מעמיקה לגבי האופן שבו יש לעבד לבלב אנושי לסוגי דגימות שונים, ובפרט את היכולת לשמור על האוריינטציה של האיבר, וכן כיצד לבודד קשרי לימפה מהשומן הפרי-פנקראטי (peripancreatic fat).