פרוטוקול משופר עבור microdissection הליזר של איי לבלב אנושיים מדוגמאות כירורגים
6 בינואר 2013
microdissection הליזר הוא טכניקה המאפשרת התאוששות של תאים נבחרים מכמויות זעירות של parenchyma. כאן אנו מתארים פרוטוקול לרכישת איי לבלב אנושיים מדגימות ניתוחיות שתשמש למחקרי transcriptomic. הפרוטוקול שלנו משפר את autofluorescence הפנימית של תאי הביתא אדם, ובכך להקל האוסף שלהם.
שלום, שמי דורטה ממכון Thea Hands באוניברסיטה הטכנולוגית, Reen Laser. מיקרודיסקציה היא טכניקה המאפשרת להשיג אוכלוסיית תאים מיוחדת מכמויות קטנות מאוד של גידול הורה. התאים המנותחים יכולים לשמש למחקרים טרנסקריפטומיים ופרוטאומיים, הערכת DNA או ניתוח כרומוזומים.
כאן אנו מספקים את הפרוטוקול שלנו לרכישת תאי מטא לבלב אנושיים מדגימות כירורגיות שישמשו למחקרים טרנסקריפטומיים. חותכים את רקמת הלבלב לחתיכות קטנות. מניחים חתיכה אחת במרכז תבנית קריו ומכסים אותה בתרכובת הטבעה צוננת.
הקפיאו את הרקמה מיד עם שני חומרים צוננים בהוטן ומאוחסנים במינוס 80 מעלות צלזיוס. חתך תווית 40 שקופיות דבק ומקרר אותן מראש בתוך החדר המשיח. תקן את הרקמה הקפואה על מחזיק הדגימה עם תרכובת ה-OCT לאחר חיתוך בלוק הקריו.
חותכים 40 חלקים בעובי 10 מיקרומטר. העבירו קטע אחד לשקופית אחת על ידי נגיעה בצד האחורי של המגלשה עם האצבע כדי לחמם רק את המיקום להנחת החלק עליו.נסו את החלקים שתיים-שלוש דקות בתוך הקריוס המתים ואחסנו אותם לאחר מכן במינוס 80 מעלות צלזיוס, הכינו את ריאגנטים של Ation וצננו את כל הנוזלים למעט סלין על קרח. זה יגדיל את האוטופלואורסצנטיות הפנימית של תאי PET לפני המיקרו-דיסקציה.
ארבעה חלקים יורדו בכל פעם. טפל בשני חלקים בבת אחת. תקן אותם תחילה ב-70% אתנול למשך 30 שניות.
לאחר מכן שוטפים את החלקים בחמישה עד שישה מטבלים מהירים. ב-DPC מים מטופלים להלן. יבשו את הרקמה דקה אחת באתנול 100% וחזרו על שלב זה, דגרו את השקופיות בסלין למשך ארבע דקות.
בינתיים, התחל בהתייבשות של זוג חלקים נוסף. לבסוף, יבש את המגלשות באוויר במשך שלוש עד חמש דקות בחושך. הגן על הרקמה מפני לחות ועל האוטו-פלואורסצנטי מפני הלבנה על ידי הנחת שתי השקופיות גב אל גב לתוך נייר כסף עטוף צינור 50 מ"ל לפני הקטע, נקה את המיקרוסקופ עם RNA הרחק והדק את מכסה הדבק לתוך המניע הרובו.
הכנס את השקופית לתוך הבמה והזיז את הכובע מקרוב מעל החלק מבלי לגעת בו. מקם את הלולאות על ידי זיהוי אזורי התאים האוטו-פלואורסצנטיים הטובים יותר. האוטופלואורסצנציה הפנימית של תאים אנושיים טובים יותר נראית צהובה במערך, בעוד שצינורות הלבלב מראים אוטופלואורסצנציה ירוקה בהירה.
בחר את אזורי התאים הטובים יותר עם כלי בחירת היד החופשית ונתח אותם במיקרו על ידי הפעלת הלייזר. נתח את הלולאות של ארבעה חלקי קריו לתוך מכסה דבק אחד תוך 40 עד 60 דקות. אם תרצה, בדוק את הרקמה שנלכדה על ידי הזזת המכסה למחסום המיקרוסקופ.
הסר את המכסה החוצה ממוביל הרובו וצנר אותו. מאגר מיצוי של 10 מיקרוליטר לתוך המכסה של המכסה לשיבוש תאים. דגרו את הפקק הפוך בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
סובב את הליזאט, סמן את הצינור ואחסן אותו במינוס 80 צלזיוס מופחת עד למיצוי ה-RNA. בצע את לייזר Ation, מיקרו דיסקציה וליזה עם כל 40 ניתוחי הקריו. לאחר מכן, אחדו את 10 הליזטים והמשיכו בבידוד ה-RNA באמצעות ערכת הבידוד UR PU RNA בהתאם לפרוטוקול שסופק להשגת 11 מיקרוליטר RNA.
באופן כללי, לא מצאנו קשר ישיר בין כמות רקמת המיקרו-דיסקט לבין תפוקת ה-RNA הבדלים במרווח הזמן בין הקציר על ידי המנתחים לבין הקפאת דגימת הלבלב לאחר בדיקתה על ידי הפתולוג, יכולים להסביר בחלקם את האיכות והכמות של ה-RNA המשוחזר. גורמי מפתח נוספים שיש לקחת בחשבון הם אנרגיית הלייזר המיושמת עבור מיקרו דיסקציה עם האנרגיה הנמוכה יותר, תוך שימוש בשלמות ה-RNA הגבוהה יותר, כמו גם מיקוד הלייזר והמרחק של נקודות ההצבעה של חותך לחץ הלייזר. בנוסף, ניתן למטב את כמות ה-RNA על ידי שמירה על המרחק בין מכסה הדבק לנמוך ככל האפשר.
הימנע מאובדן של רקמה מיקרו מנותחת במהלך תהליך הלכידה, בתנאי שמיקרוסקופ מיקרו דיסקציה בלייזר זמין. הליך זה יכול להיות מיושם בכל מוסדות מחקר המבצעים כריתת לבלב חלקית, ובכך להגדיל את הגישה לחומר עפעפיים אנושיים מנבדקים שאינם סוכרתיים וסוכרתיים כאחד.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול למיקרודיסקציה בלייזר לשחזור איים הלבלביים אנושיים מדגימות כירורגיות. הטכניקה משפרת את איסוף תאי הבטא למחקרים טרנסקריפטומיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- טרנסקריפטומיקה
רקע
- מיקרו-דיסקציה בלייזר מאפשרת בידוד של אוכלוסיות תאים ספציפיות.
- זה שימושי במיוחד עבור דגימות רקמה קטנות.
- ניתן ליישם את הטכניקה במגוון מחקרים, כולל אנליזות טרנסקריפטומיות ופרוטאומיות.
- שיפור האוטופלורסצנציה מסייע באיסוף תאים ממוקדים.
מטרת המחקר
- אספקת פרוטוקול מפורט להשגת איים לבלב אנושיים.
- סיוע בחקר תאי בטא במחקרי טרנסקריפטומיקה.
- שיפור היעילות של איסוף תאים מדגימות כירורגיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טכניקת מיקרו-דיסקציה בלייזר המיושמת על רקמת לבלב.
- הכנת דגימות רקמה על ידי חיתוך לחתיכות קטנות.
- הטמעה של הרקמה בתרכובת מקוררת לצורך דיסקציה אופטימלית.
- איסוף תאי בטא להמשך ניתוח.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של איים הלבלב אנושיים.
- נצפתה אוטופלואורסצנציה משופרת של תאי בטא.
- הפרוטוקול הוכיח יעילות עבור מחקרי טרנסקריפטומיקה.
- אפשר איסוף של אוכלוסיות תאים ממוקדות מדגימות קטנות.
מסקנות
- הפרוטוקול משפר את התשואה של איים הלבלב אנושיים.
- מיקרו-דיסקציה בלייזר היא כלי בעל ערך לניתוח תאי.
- שיטות משופרות יכולות להוביל לתובנות טובות יותר במחקר טרנסקריפטומי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
מיקרו-דיסקציה בלייזר (Laser microdissection) מאפשרת בידוד מדויק של תאי בטא של הלבלב אנושי מדגימות כירורגיות מוגבלות, ובכך פותרת צוואר בקבוק קריטי במחקרי טרנסקריפטומיקה של רקמות הרלוונטיות לסוכרת. באמצעות הגברת האוטופלורסצנציה האינטרינסית באמצעות עיבוד ריאגנטים קרים מאוד (ice-cold), הפרוטוקול מקצר את זמן הטיפול ברקמה ומשפר את שימור ה-RNA, ובכך תומך באופן ישיר בתיקוף מטרות במחקר של מחלות מטבוליות. גישה זו מחזקת את הפחתת הסיכונים המכניסטיים (mechanistic de-risking) על ידי אספקת אוכלוסיות תאים מטוהרות ליישומי אומיקה (omics) במורד הזרם בתהליכי גילוי מוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי בידוד אוכלוסיות טהורות של תאי בטא לצורך ניתוח מסלולים במודלים של סוכרת מסוג 2.
- ערך תפעולי: מסייע בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות זיהוי מהיר ומדויק של תאי מטרה באמצעות פלואורסצנציה עצמית מוגברת, ובכך מפחית את כמות התוצאות החיוביות השגויות בבחירת המטרה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות שעברו ולידציה לצורך סטנדרטיזציה של בדיקות, על ידי אספקת תשומות RNA עקביות ובעלות שלמות גבוהה מאיים שבוצע להם מיקרו-דיסקציה.
- ערך תפעולי: תומך בתוצרים כמותיים הניתנים לשחזור, החיוניים למוכנות לסריקה ולשימוש חוזר בפלטפורמה במסלולי גילוי של סמנים ביולוגיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על הרלוונטיות למחלה על ידי מתן אפשרות לניתוח טרנסקריפטומי של איים לבלב אנושיים הקשורים ישירות לפתופיזיולוגיה של סוכרת.
- ערך תפעולי: מבטיח המשכיות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות אספקת אוכלוסיות תאים מוגדרות למחקרי מעקב מכניסטיים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי על ידי מתן אפשרות לבדיקת השערות בשלבים מוקדמים של הביולוגיה, תמיכה בפיתוח בדיקות באמצעות תשומות סטנדרטיות, וסיוע בקבלת החלטות תרגומיות באמצעות פרופיל מולקולרי כמותי.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בהבהרת מסלולים ובהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי בידוד תאי בטא לצורך תיקוף פונקציונלי של מטרות במודלים של מחלות מטבוליות.
- סריקה: מספקת דגימות מוכנות לבדיקה עם תנובת RNA ניתנת לשחזור, דבר קריטי לסריקת השפעות של תרכובות על איים מבודדים.
- אנליטיקה: מייצרת תוצאות טרנסקריפטומיות כמותיות המאפשרות השוואה בין מצבים סוכרתיים לבלתי-סוכרתיים כדי לסייע בזיהוי מועמדים מובילים.
- מחקר טרנסלציונלי: מקשר לרציפות פרה-קלינית על ידי אספקת דגימות רלוונטיות לבני אדם המגשרות בין ממצאים in vitro למנגנוני מחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת ניתנת לשימוש חוזר לגישה לאיי לבלב אנושיים ראשוניים במגוון פרויקטים, ובכך מפחיתה את התלות במקורות תורמים משתנים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את ביטחון התחזית על ידי הפחתת עמימות מכניסטית במסלולי אותיות ספציפיים לתאי בטא.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות באמצעות עיבוד רקמות מבוקר ופרמטרי ניתוח מוגדרים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go על ידי מתן אפשרות להערכה מוקדמת של מעורבות המטרה בתאים רלוונטיים לבני אדם, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על פורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם-סיכון של מטרות לסוכרת על בסיס פרופילים טרנסקריפטומיים מאומתים של איים בלבקר בני אדם.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהיסטולוגיה, חיתוך קריוסטטי ותפעול מכשור למיקרודיסקציה בלייזר.
- תלוי בגישה למערכת PALM MicroBeam או לפלטפורמת LMD שוות ערך בעלת יכולת AutoLPC.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים לטיפול בריאגנטים כדי לשמור על אוטופלואורסנציה ועל שלמות ה-RNA בין משתמשים שונים.
- כולל שיקולי התאמה לאיכות משתנה של דגימות לבלב ולזמן איסכמיה שבין האיסוף להקפאה.
- מוגבל על ידי אילוצי תנובת ה-RNA, מה שמחייב איחוד של מספר דגימות שעברו מיקרודיסקציה כדי להגיע לכמות קלט מספקת עבור ערכות המשך.
