ביצית אחת bisulfite mutagenesis

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לנתח מתילציה של DNA בביצית בודדת. זאת מושג תחילה על ידי הסרת תאי קומולוס ו-soap palita מביציות שנאספו. השלב השני הוא הטמעת הביצית בתוך תמיסת aros lysis ביחס של שתיים לאחת, כדי להגן על כמות ה-DNA הזעירה מפני אובדן או פירוק.

בשלב הבא מבוצע מוטגנזיס באמצעות ביסולפיט, ולאחריו הגברה באמצעות תגובת שרשרת פולימראז מקננת (nested PCR). השלב הסופי הוא ליגציה ושבט של תוצר ה-PCR. לאחר מכן נבחרים שבטים, מוגברים באמצעות PCR ונשלחים לריצוף.

בסופו של דבר, נעשה שימוש במוטגנזה של ביסולפיט וריצוף כדי להראות מתילציה של DNA בציטוזין-פוספט-גואנין, או דינוקלאוטידי CPG, של אזור עניין בביצית בודדת. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מוטגנזה של ביסולפיט במספר תאים גדול, הוא שניתן להשיג נתונים מביצית בודדת ללא איחוד תאים, הטיות של PCR וזיהום של תאי כימיה. ביום איסוף הביציות, הכין טריים את התמיסות המפורטות בפרוטוקול הכתוב; בעת הכנת התמיסות, הפחת את הסיכון לזיהום DNA על ידי החלפת כפפות לעיתים קרובות ושימוש בקצוות מסננת (filter tips); כמו כן, השאר את המבחנות בזווית הרחק ממך כשהן פתוחות, והחזר את הפקקים לכל המבחנות כאשר אינן בשימוש.

התחילו את איסוף ה-OSI על ידי הנחת תることができます המפוצלות של העכבר לתוך מצע M two ומשיכת הפולי M כדי לחלץ את קומפלקס תאי הענן (cumulus cell complex). לאחר מכן, הפרידו את הציטות (cytes) מקומפלקס תאי הענן באמצעות תמיסת היאלורונידאז בריכוז 0.3 milligrams per milliliter בטיפה של 30 microliter של מצע M two. השאירו את הציטות בתמיסה רק למשך הזמן הדרוש להסרת תאי הענן, שכן חשיפה ממושכת עלולה לפגוע בהם.

שטפו את התבويضיות בטיפות של 30 µL של מצע M two על ידי העברת התבويضיות מטיפה לטיפה. הסירו את תאי הקומולוס מדי פעם, עבור סך של שלושה שטיפות. הסירו את ה-Z של LUCITA באמצעות תמיסת tyro חומצית.

ראשית, הניחו את התאים הביצית (oocytes) בטיפה אחת של 30 microliter מהתמיסה, ולאחר מכן העבירו אותם לטיפה נוספת של 30 microliter. זאת מכיוון שכל מדיום שיועבר ידלל את החומצה ויפחית את יעילותה. השאירו את התאים בתמיסה רק למשך הזמן הדרוש להסרת ה-zona, שכן חשיפה ממושכת עלולה לפגוע בהם.

לאחר הסרת ה-zona, שטפו שוב את התאים בטיפה של 30 µL של מצע M2. כדי לבצע שיכון ב-Agarose, הניחו תחילה את תמיסת הליזיס על בלוק חימום בטמפרטורה של 70 °C. הוסיפו את ה-Agarose בעל נקודת ההמסכה הנמוכה (LMP Agarose) שחומם מראש אל תמיסת הליזיס, כך שייווצר יחס של 2:1 בין ה-Agarose לתמיסת הליזיס. לאחר מכן, הניחו אווציט בודד על למסת זכוכית נקייה בכמות מינימלית של מצע M2.

השלב הבא הוא להטמיע את התא הבודד לתוך תמיסת ה-Agros והליסיס. יש לבצע זאת במהירות, שכן ה-Agros יתקשה בטמפרטורות הנמוכות מ-65 °C. שאבו 10 µL של תמיסות הליסיס Agros לתוך טיפ של פיפט תחת מיקרוסקופ.

הוצאו בעדינות כ-1 µL או פחות מתמיס הליזיס של agros על גבי הפס גלס, ואפשרו לו להתערבב עם המצע המינימלי. שאבו בעדינות את הביצית (oocyte) לתוך קצה הפ pipette. לאחר מכן, העבירו את כל 10 µL לשפופרת einor המכילה 300 µL של שמן מינרלים, כך שהטיפה שנוצרת תקבל צורה כדורית.

דגרו את המבחנה על קרח למשך 10 דקות כדי לבצע ליזיס. הסירו 300 µL של שמן מינרלי והוסיפו 500 µL של תמיסת SDS lysis buffer. דגרו את הדגימה למשך לילה במבן מים המכוון ל-50 °C ביום השני.

הכינו את תמיסות המוטגנזה של bi sulfide באופן טרי כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. התחילו את המוטגנזה על ידי הסרה מלאה של 500 microliters של SDS lysis buffer. זכרו כי כל שארית של lysis buffer תדלל את ה-agros בעת החימום, והחרוז יהיה רגיש יותר להמסה בשלבים הבאים.

לאחר הסרה מלאה של תמיסת הליזיס (lysis buffer), הוסף 300 µL של שמן מינרלי. דגרי את הדגימה למשך שתיים וחצי דקות על בלוק חימום בטמפרטורה של 90 °C. היזהר לא לערבב, לנער או לגרום לתנודות בטמפרטורה.

לאחר שתי דקות וחצי, דגרו את הדגימה על קרח למשך 10 דקות. לצורך ביצוע דנטורציה, הסירו את השמן המינרלי והוסיפו למבחנה 1 מיליליטר של sodium hydroxide בריכוז 0.1 molar; נערו בעדינות והפכו את המבחנה חמש עד שש פעמים.

דגרו את הדגימה למשך 15 דקות. באמבט מים המכוון ל-37 °C, תוך היפוך כל שלוש עד ארבע דקות, החרוז אמור לצוף בנתרן הידרוקסיד. שימו לב שהחרוז אינו נמצא עוד בתחתית המבחנה.

לביצוע טיפול בסולפיט, סובב תחילה את המבחנה בעדינות לאחר הסרת הנתרן הידרוקסיד. הוסף 300 µL של שמן מינרלי ו-500 µL של תמיסת BIS sulfite. הקפד להימנע מחשיפה לאור והדגר את המבחנה למשך שלוש שעות וחצי במקלח מים של 50 °C.

כעת בצעו דנטורציה. ראשית, דגרו את הדגימה על קרח למשך שלוש דקות לפני הסרת השמן המינרלי ותמיסת ה-BIS sulfite. לאחר סבוב קצר במצנטריפוגה, הוסיפו מיליליטר אחד של sodium hydroxide בריכוז 0.3 molar, ונערו את הפועלה על ידי נקישה והפיכה של המבחנה חמש עד שש פעמים.

דגרו את הדגימה למשך 15 דקות. במבחנה בתוך מקבץ מים בטמפרטורה של 37 °C, הפכו את המבחנה כל שלוש עד ארבע דקות; שוב, החרוזים צריכים לצוף בתוך ה-sodium hydroxide לפני תחילת ה-PCR. שטפו את הדגימות תחילה על ידי סבוב עדין בצנטריפוגה.

לאחר מכן, הסירו את הנתרן הידרוקסיד והוסיפו מיליליטר אחד של 1x XTE ב-pH 7.5. נערעו במשך 5 עד 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר סבב סנטריפוגה עדין שני, הסירו את ה-1XTE.

חזור על תהליך שטיפה זה פעמיים. לאחר מכן, הוסף 1 mL של מים מזוקקים פעמיים שעברו עיקור באוטוקלאב. נער במשך 5 עד 10 דקות בטמפרטורת החדר, סבב בעדינות בפעם שלישית והסר את המים.

חזור על השטיפה במים מזוקקים פעמיים. לבסוף, הסר את כל הנוזל העליון (supernatant), כך שיישאר רק חרוז ה-aros. ודא כי ה-pH של הנוזל העליון הוא 5.0.

אם הנוזל העליון עדיין בסיסי מדי, שטפו את החרוזיים שוב במים מזוקקים פעמיים. בינתיים, הוסיפו את תערובת ה-PCR של הסבב הראשון לשפופרת ה-PCR כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. החליקו את ה-solid agro speed אל שפת שפופרת ה-einor.

לאחר מכן, העבירו בזהירות את ה-agro speed למבחורת PCR, חממו ל-70 °C למשך דקה אחת וערבבו, ולאחר מכן בצעו הגברה כפי שמוצע בפרוטוקול הכתוב. בעקבות סבב ההגברה הראשון, הכינו תגובת PCR לסבב השני תוך שימוש ב-5 µL מתוצר הסבב הראשון כתבנית. ודאו כי הפיפטינג יתבצע מתחת לשכבת השמן המינרלי.

המשיכו בביצוע סבב ההגברה השני כפי שהודרך בטקסט כבדיקה דיאגנוסטית. ניתן לחתוך דגימות מהסבב השני באמצעות אנזים הגבלה הספציפי למתילציה או לזן, ולהריץ את תוצרי העיכול באלקטרופורזה על ג'ל אקרילאמיד 8%. כל פס פסו heterogenous שיתקבל מייצג יותר מרצף אחד. כדי לשבט את תוצר הסבב השני, בצעו ליגציה אל הווקטור ושבט TA כפי שמתואר בכתב היד המצורף לסרטון זה. לאחר שיבוט ה-TA, פזרו את כל תערובת התגובה על צלחת אגר LB, המועשרת באמפיסילין, X-gal ו-IPTG, והדגרימו את הצלחת בטמפרטורה של 37 °C למשך הלילה.

לאחר מכן, הוסיפו את תערובת ה-PCR למושבות (colony PCR master mix) לשפחור ה-PCR כמפורט בפרוטוקול הכתוב. בחרו מושבה חיידקית לבנה מהצלחת בעזרת קצה פפטה וערבבו אותה לתוך 35 µL של תערובת ה-PCR למושבות בשפחור PCR. המשיכו להגביר את התליה כפי שמתואר בטקסט לאחר הגברת ה-PCR; בצעו אלקטרופורזה ל-4 µL מתוצר ה-PCR על ג'ל AGROS בריכוז 1.5%.

לבסוף, שלחו כ-30 µL של תוצר ה-PCR לריצוף של חמישה colony PCRs לכל תא. לאחר קבלת תוצאות הריצוף, ניתן לקרוא את דפוסי המתילציה; כל ציטוזין-גואנין מקורי שנותר ככזה היה מתומתיל. לעומת זאת, כל ציטוזין-גואנין מקורי שהפך כעת לתימין-גואנין לא היה מתומתיל בעקבות הגברה של nested PCR באמצעות פריימרים שהומרו בביסולפיט.

ניתן לאשר המרה מוצלחת על ידי ויזואליזציה של גודל פרגמנט נכון בג'ל agarose של מטאפזה בודדת. כל ציטה מייצגת אלל הורי אחד ובתאוריה בעלת תבנית מתילציה מודפסת (imprinted) אחת. ניתן לבדוק את תוצרי ה-PCR מסבב שני כדי לזהות זיהום לא מכוון.

ניתן להשתמש באנזים הגבלה הרגיש למתילציה של DNA כדי לעכל את תוצר ה-PCR של הסבב השני, במטרה להעריך אם הוא מכיל אלל מתילציה או אלל שאינו מתילציה. במקרה זה, ציטוזין מתילציה בתוך רצף הזיהוי של האנזים נחתך. לעומת זאת, ציטוזין שאינו מתילציה אשר הומר לתימין אינו מזוהה יותר על ידי האנזים ואינו נחתך; כל דגימת ציטה שלב מטאפאזה II המכילה הן אללים מתילציה והן אללים שאינם מתילציה צריכה להי discarded כיוון שהיא מעידה על זיהום על ידי תאי קומולוס או הכללה של גוף קוטבי לאחר הליגציה והטרנספורמציה.

ניתן להדמיות הגברה מוצלחת של Colony PCR על ג'ל AROS כדי להבטיח שדגימות עם גודל המוצר הנכון יישלחו לריצוף. בדוגמה זו, גודל האמפליקון הצפוי לאחר ליגציה הוא 56 זוג בסיסים. במקרה זה, לכלון חמישה יש גודל אמפליקון שגוי והוא אינו צריך להישלח לריצוף.

הרצף של חמישה שיבוטים (clones) בודדים מביצית בשלב מטאפאזה II אמור להניב חמישה תבניות מתילציה זהות ושיעורי המרה זהים של non CPG. יש להשליך כל דגימה המכילה יותר מתבנית אחת. מכיוון שביציות בביוץ בשלב מטאפאזה II מכילות שני עותקים של כרומוזומים או גוף קוטבי צמוד, קיימת אפשרות לקבל שתי תבניות רצף דומות.

יש להשליך נתונים מכל התאים שאתרי המתילציה שלהם שונים באופן משמעותי. מאחר שלא ניתן לשלול זיהום על ידי תאי קומולוס בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור ראשית לשטוף את התאיביצים מספר פעמים במצע טרי, לאחר הטיפול ב-HI IDE, כדי להסיר כמה שיותר תאי קומולוס. שנית, ה-agar בעל נקודת ההמס הנמוכה יתקשה בטמפרטורות הנמוכות מ-65 °C, לכן יש לעבוד בזהירות אך במהירות.

ולבסוף, נתרן ביסולפית והידרוקינון רגישים לאור, ולכן יש לעטוף את מבחנות התגובה והתמיסות בנייר אלומיניום.