הקלטה אופטית של פעילות עצבית suprathreshold עם רזולוצית תא בודד ויחיד ספייק

המטרה הכללית של ניסוי ה-FollowMe היא להקליט פעילות של פוטנציאלי פעולה (spiking activity) ממספר רב של נוירונים. מטרה זו מושגת בשלב הראשון על ידי תצפית בעלייה בריכוז הסידן התוך-תאי בגוף התא של הנוירון הנלווית לכל פוטנציאל פעולה, באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה. עירור דו-פוטוני ועקרון סריקה בגישה אקראית (random access scanning) משמשים להקלטת אותות פלואורסצנציית סידן מ-40 גופי תא של נוירונים ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה.

בשלב השני, זמני הפריקה המדויקים מופקים מהאותות הפלואורסצנטיים באמצעות אלגוריתם דקונבולוציה (deconvolution). ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי להקליט פעילות פריקה מעשרות נוירונים. את נתוני הפריקה ניתן להשתמש בהם לאחר מכן כדי למדוד מידע הדדי, התפשטות אותות בין אוכלוסיות נוירונים או קורלציות נוירונליות.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון הקלטות באמצעות מיקרו-אלקטרודות, הוא היכולת להקליט פעילות של פריקות נוירונים ממספר רב של נוירונים מאוכלוסייה מקומית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח לגבי תפקוד קורטקלי ברמת רשתות מקומיות של נוירונים, כגון החשיבות של חיפוש קורלציות של מידע ושינויים בדינמיקה של רשתות עם פלסטיות קורטקלית. עבור עירור דו-פוטוני, נעשה שימוש במערכת לייזר פולסים באינפרא-אדום עם פולסים של פמטושניות. נדרשת הספק פלט גבוה של הלייזר כדי לפצות על ההפסדים הגדולים הנגרמים על ידי הרכיבים האופטיים של המערכת.

מפזר המורכב משני מנסרים מעניק פיזור מהירות קבוצה שלילי לפולסי הלייזר לפני המסריפים האופטיים המותאמים, כדי לפצות על הפיזור הזמני שנוצר על ידי ה-AODs. שני AODs עם מפתחים גדולים מסיטים את קרן הלייזר בשני ממדים. סריג עקיפה מחזיר עם 100 חריצים למטר ממוקם 13 סנטימטרים מאחורי ה-AODs כדי לפצות על הפיזור המרחבי שנוצר על ידי ה-AODs. בעת שימוש בפולסי לייזר קצרים, קרן הלייזר מופנית באמצעות שני טלסקופי ממסר לפתח המצלמה של מיקרוסקופ זקוף.

צמצמים ממוקמים במרווחים קבועים לצורך יישור הרכיבים האופטיים. מפחית קרן דיכרואי לפני העדשה משגר את אור העירור שבאינפרא-אדום אל הדגימה ומחזיר את אור הפלואורסצנציה מהדגימה אל גלאי. גלאי פלואורסצנציה מסוג Epi ו-trans אוספים את אות הפלואורסצנציה דרך העדשה, ומסנני זכוכית צבעוניים של המעבה ממוקמים לפני הגלאים כדי למנוע מאור העירור להגיע אליהם.

זוויות ההסטה של ה-A OD נשלטות על ידי מחשב המצויד בלוח ממיר דיגיטלי-אנלוגי, המפעיל בתורו מתנדים הנשלטים על ידי מתח. האות מהפוטו-מכפילים מועבר דרך מסנן Butterworth למעבר נמוך עם תדר חיתוך של 100 kilohertz ומודגס על ידי ממיר אנלוגי-דיגיטלי בקצב שעון של 156.25 kilohertz לפני אחסונו במחשב לצורך ניתוח; כיוון ורעש חשמלי נבדקים על ידי הקלטת התפלגות אותות פלואורסצנציה עם ובלי אור לייזר בהגבר נמוך וגבוה של הפוטו-מכפילים, וכן עם ובלי אינדיקטור. סריקה אקראית בגישת dithered random access מסתמכת על זיהוי עליות תוך-תאיות בריכוז הסידן. השלב הראשון בפרוטוקול הוא צביעת מספר רב של נוירונים באמצעות צורת האסטר של אינדיקטור לסידן על ידי הזרקת bolus.

בשלב הבא, רשמו את הפעילות של הסומה בכל נוירון בארבעה מיקומים למשך 6.4 microseconds בכל מיקום. כדי לבחור את הנוירונים הרלוונטיים, רכשו פריים מלא המורכב מ-256 על ידי 256 פיקסלים. לאחר מכן, בחרו ידנית את מרכזי הנוירונים שיוקלטו בתוך תמונה זו.

תוכנת הבקרה מוסיפה באופן אוטומטי בכל מחזור שלוש נקודות במרחק של 2 µm סביב כל מרכז. אות פלואורסצנציה נרשם מארבעה מיקומים בכל 40 הנוירונים. רישום מכל הנוירונים במחזור אחד דורש 1.536 מילישניות.

חזור על הקלטה רצפית זו של כל 40 הנוירונים למשך חמש שניות. זיהוי ספייקים (Spikes) מאותות סידן סומטיים פלואורסצנטיים מסתמך על יחס אות לרעש גבוה. ניתן להשיג יחס אות לרעש גבוה על ידי הגברת עוצמת העירור.

עם זאת, ניתן להעלות את עוצמת העירור רק עד גבול מסוים בשל נזק פוטוני. קיים חלון צר מאוד של עוצמת עירור שבו הנזק הפוטוני נמוך ויחס אות לרעש מספיק כדי לזהות קוצים (spikes) בודדים, וזאת כדי להבטיח שהאותות המוקלטים נמצאים בטווח של זיהוי קוצים גבוה. במהלך ניסוי, נעשה שימוש במספר תוכנות ניתוח מקוונות שפותחו במעבדה שלנו.

בשלב הבא, חשבו את קצב הפוטונים המשוער לניורון מחלון זמן קצר של רעש רקע (baseline noise) באורך של כ-100 עד 200 מילישניות. מספר הפוטונים וקצב הפוטונים מחושבים מערכי הפלואורסצנציה על ידי התאמה של התפלגות שינויי הפלואורסצנציה היחסיים למשוואה זו; לאחר מכן, חשבו את הפלואורסצנציית הרקע מאותו חלון זמן ושרטטו אותה כפונקציה של הזמן או של מספר הניסיונות. שמרו על ירידה ממוצעת של רקע הנמוכה מ-0.0002 לשנייה על ידי כיוונון הספק הלייזר.

מכיוון שזיהוי הספייקים יורד במהירות כאשר חורגים מגבלה זו. לאחר מכן, ודאו את מיקומי הסומות של הנוירונים כל 10 עד 20 דקות על ידי רכישת תמונת פריים מלאה. התאימו את מיקומי ההקלטה במידת הצורך.

האותות הפלואורסצנטיים הנובעים מפעילות עצבית הם לרוב איטיים במישור הזמן בשל הדעיכה הממושכת של הטרנזיינט של הסידן. בהליך זה, נעשה שימוש בשיטת דקונבולוציה (deconvolution) כדי להסיק פולסים (spikes) ותזמוני פולסים מהאותות הפלואורסצנטיים. כאן אנו משתמשים באלגוריתם גנטי כדי לקבוע את מודל רצף הפולסים הסביר ביותר המתאים לאות הפלואורסצנטי שהוקלט.

עם כל חזרה של האלגוריתם, הסבירות המקסימלית שואפת אסימפטוטית למקסימום שנקבע על ידי הרעש של הקלטות הפלואורסצנציה. באוכלוסיות לא הומוגניות של נוירונים, אות הסידן המעורר על ידי פוטנציאל פעולה (spike) עשוי להשתנות בין נוירונים. לצורך ניתוח לא מונחה של מערכי נתונים גדולים, תכננו אלגוריתם הלוקח בחשבון את השונות של אות הסידן המעורר על ידי פוטנציאל פעולה מנוירון לנוירון, וזאת כדי למנוע מספר רב של זיהויים חיוביים שגויים.

ההתפלגות המשותפת של האמפליטודה וקבוע זמן הדעיקה של טרנזיינט סידן שעורר על ידי ספייק בודד נרשמה בסדרה נפרדת של ניסויים מאותו סוג של נוירונים תחת אותם תנאי ניסוי. כדי להתחשב בשינויים איטיים בקו הבסיס ולהפחית את העלויות החישוביות של ה-deconvolution, הקלטות ארוכות מחולקות למספר עקבות קצרים יותר של אחת עד חמש שניות עבור כל נוירון בכל הקלטה. אלגוריתם ה-deconvolution עשוי לבחון מספר רב של מודלים, עד מיליון מודלים שונים או יותר; כדי להאיץ את ה-deconvolution, ניסוי אחד עובר deconvolution על עד 10 מחשבים שונים במקביל.

לאחר דקונבולוציה, נתוני הפולסים (spikes) מנותחים ונבדקים. הסתברות הפולסים בהיסטוגרמת הזמן סביב הגירוי (peri stimulus time histogram) וקצב הפריקה של הנוירון מחושבים באופן אוטומטי. להלן דוגמאות לאות פלואורסצנציה שהוקלט בקצב עירור נמוך מאוד, ואחרת שהוקלט בקצב עירור גבוה מאוד בתוך חלון הזיהוי.

שימו לב שכל דוגמה מציגה את התגובה לספייק (spike) אחד. מוצגת כאן תמונת מיקרוסקופ של פרוסת מוח חדה ושתי פיפטות גירוי הממוקמות באותה עמודה קורטיקלית. בשכבה ארבע, אלה מציגים תגובות עצביות לגירויים חוזרים, וגרף זה מציג את המידע ההדדי של שאנון (Shannon's mutual information) כפי שסומן על ידי אוכלוסיית הנוירונים שהוקלטה.

כאן מוצגת מדידה של התפשטות פעילות פוטנציאלי פעולה מעל הסף בין אוכלוסיות שונות של נוירונים קורטיקליים. אלו הם פולסים (spikes) שזוהו בנוירונים קורטיקליים, כתגובה לגירוי חשמלי של סיבים תלמו-קורטיקליים. בעת הקלטת פעילות נוירונלית באמצעות סריקה בגישה אקראית (random access scanning), חשוב מאוד להקליט בתוך חלון הזיהוי.

אחרת, קל מאוד להגיע למצבים שבהם מערכי הנתונים אינם שמישים. זיהוי ספייקים (spikes) אופטיים נמצא עדיין בראשיתו, ויש מקום רב לשיפור.

בעזרת מספר שיפורים, אנו מקליטים מנוירונים רבים אף יותר. בעזרת שיפורים אחרים, נוכל להקליט אף מבעלי חיים ערים ובמצב של התנהגות.