מדידת תא בודדה של שחרור דופמין במתח-clamp וAmperometry סימולטני
21 בנובמבר 2012
טכניקת amperometric מודדת שחרור דופאמין מתא בודד על ידי גילוי נוכחי חמצונים המיוצרים על ידי חמצון דופמין ספונטני. מהדק המתח סימולטני ומתודולוגיה amperometry לחשוף את מערכת היחסים בין מכניסטית "הפעילות" הכוללת של טרנספורטר דופאמין ותפקיד הרגולציה של פעילות זו על ההובלה ההפוכה של דופמין.
מטרת הליך זה היא למדוד את ההובלה ההפוכה של דופמין בנוירון הנמצא תחת קיבוע מתח (voltage clamp), תוך שימוש בו-זמני ב-patch clamp ובפירומטריה כדי למדוד שחרור של D המתווך על ידי DAT. דבר זה מושג תחילה על ידי בדיקת תקינותה של האלקטרודה הפירומטרית באמצעות דופמין. השלב השני הוא מיקום האלקטרודה הפירומטרית בקרבת התא והשגת patch של התא השלם (whole cell patch) של הנוירון באמצעות פיפטת patch.
בשלב הבא, השליטה במתח של התא מתבצעת באמצעות פיפטת ה-patch, ובמקביל נמדדת שחרור הדופמין המתווך על ידי ה-DAT באמצעות אלקטרודה פירומטרית. השלב האחרון הוא הוספת חוסם DAT והקלטה חוזרת של זרמי התא השלם והפירומטריה, כדי לאפשר את החסירה של הזרם המתווך ספציפית על ידי נשא הדופמין. המשמעות של טכניקה זו היא היכולת למדוד הובלה הפוכה של דופמין דרך נשא הדופמין תוך כדי שליטה סימולטנית במתח של הנוירון הדופמינרגי.
מערכת ההקלטה הסימולטנית של patch clamp וברומטריה דורשת מיקרוסקופ הפוך בעל אופטיקת DIC מעולה ועדשה בעלת מרחק עבודה ארוך כדי להפיק מקור אור DC עבור המערכת. תחת רעש חשמלי נמוך, חברו את תאורת המיקרוסקופ לסוללת רכב. נעשה שימוש במיקרו-מניפולטורים הידראוליים מכיוון שהם אינם תורמים באופן משמעותי לרמות הרעש בתצורה שלנו.
מניפולטור ימני משמש לבקיעת מתח (voltage clamp) והקלטה של התא השלם (whole cell recording), והמניפולטור השמאלי משמש לפירומטריה. כדי להכין את האלקטרודה להקלטה של התא השלם, יש למשוך פיפטת קוורץ באמצעות שובך P 2000. בדרך כלל, אנו משתמשים בפיפטה בעלת התנגדות של שלושה עד ארבעה מגה-אוהם.
בשלב הבא, מלאו את האלקטרודה בתמיסת הפיפטה המכילה 1 mM דופמין. לאחר מכן, התקינו אותה על מחזיק הפיפטה במניפולטור הימני. הקפידו לעטוף בנייר אלומיניום את המכל המכיל את תמיסת הפיפטה עם הדופמין ולשמור אותו על קרח כאשר אינו בשימוש.
מכיוון שדופמין ניתן לחמצון, שמירת התמיסה על קרח והגנתה מהאור יפחיתו את קצב החמצון. השחיל את תיל הכסף לתוך תוכן האלקטרודה, ולאחר מכן הברג את המתאם הפרמטרי על תוכן האלקטרודה. לאחר מכן, מלא את אלקטרודת ה-tric בכמות מספקת של כספית כדי ליצור מגע עם תיל הכסף.
בעת התקנת האלקטרודה למתאם, יש לבדוק תחת המיקרוסקופ את ה-pro CFE low noise carbon fiber ואת האלקטרודה הפרמטרית כדי לוודא שהחוד נקי ושלם. יש להחזיק את הקצה הרחוק של סיב הפחמן כדי להגן על חוד סיב הפחמן מפני נזק. לאחר מכן, התקינו את אלקטרודת ה-pro CFE Tric.
לאחר מכן, רכבו את האלקטרודה המורכבת על המניפולטור ההידראולי השמאלי כדי לבחון את תקינותה של אלקטרודת ה-tric. הורידו אותה אל תוך צלחת פטרי בעלת תחתית זכוכית המכילה את התמיסה החיצונית. רשמו את זרם הבסיס בהיעדר דופמין.
לאחר מכן, הוסיפו לצלחת 10 µL של תמיסת dopamine בריכוז של 1 mM. אלקטרודה אמפרומטרית תקינה צריכה להקליט עלייה בזרם החיסון. הקפידו לבדוק את תקינות האלקטרודה האמפרומטרית לפני ואחרי הניסויים.
בנוהל זה, הוצא מהאינקובטור את נוירוני הדופמין או את התאים שהונדסו לבטא טרנספורטר דופמין והנחו בצלחת פטרי בעלת תחתית זכוכית. שטוף בעדינות את התאים או את נוירוני הדופמין שלוש פעמים עם תמיסה חיצונית חמה. כדי לדמות את התאים ולבצע את הניסוי, הצמד את צלחת הפטרי בעלת תחתית הזכוכית לשולחן המיקרוסקופ ומצא את נקודת המיקוד הנכונה כדי לראות את התאים בבירור.
בשלב הבא, הפעל לחץ חיובי על אלקטרודת ה-patch. באמצעות מזרק של one milliliter, הורד בעדינות את שתי האלקטרודות אל תוך התמיסה והקרב אותן אל התא בעזרת המיקרו-מניפולטורים. לאחר מכן, מקם את אלקטרודת ה-emper metric בצד השמאלי של התא ואת אלקטרודת ה-patch בצד הימני.
כאשר אלקטרודת ה-patch נוגעת בתא, יש להפעיל שאיבה קלה באמצעות הפה או מזרק כדי ליצור giga seal על התא. לאחר מכן, יש לשבור את האטם באמצעות שאיבה כדי להגיע לקונפיגורציית whole cell, ולהמתין חמש עד שמונה דקות לדיאליזה של התמיסה הפנימית המכילה דופמין לתוך התא.
לאחר מכן, רשמו את הזרמים המתווכים על ידי DAT על ידי שינוי מתח קרום התא בין 60- ל-100+ מיליוולט, ממתח החזקה של 40- מיליוולט דרך הפיפט. כדי לקבוע את זרימת הדופמין הספציפית המתווכת על ידי DAT, רשמו את הזרמים האמטריים בהיעדרה ובנוכחותו של אנטגוניסט ל-DAT. הזרם הספציפי המתווך על ידי DAT נקבע לאחר מכן על ידי חיסור העקומות שנרשמו בנוכחות אנטגוניסט ל-DAT מהעקומות האמטריות שנרשמו ללא האנטגוניסט.
סטיה כלפי מעלה בזרמי ה-tric תואמת לזרימה החוצה של דופמין כפי שמוצג כאן. זרמים המתווכים על ידי DAT שנרשמו על ידי שינוי מתח הממברנה ב-20 millivolts בין מינוס 60 לפלוס 100 millivolts מפוטנציאל החזקה של מינוס ארבע C millivolts, כאשר הפ pipette מכילה 2 millimolar דופמין במצב whole cell patching. כאן מוצג הזרם האמפרומטרי שנרכש בו זמנית עם זרם ה-whole cell.
לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן המדידה של הובלה הפוכה של דופמין באמצעות נשא הדופמין בנוירון תחת קיבוע מתח (voltage clamp). זכרו לבדוק את תקינות האלקטרודה הפרמטרית לפני ואחרי הניסויים, ואל תשכחו להחסיר את העקבות שהוקלטו בנוכחות האנטגוניסט מהעקבות שהוקלטו ללא האנטגוניסט.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר טכניקה למדידת הטרנספורט ההפוך של דופמין בנוירונים באמצעות שילוב סימולטני של patch clamp ופירומטריה. השיטה מאפשרת להעריך שחרור המתווך על ידי טרנספורטר הדופמין (DAT) תוך כדי בקרת המתח של הנוירון.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- דינמיקה של מוליכים עצביים
רקע
- דופמין הוא מוליך עצבי קריטי המעורב בתפקודי מוח שונים.
- נשא הדופמין ממלא תפקיד מרכזי בוויסות רמות הדופמין.
- הבנת מנגנוני הטרנספורט ההפוך חיונית להבנת הסיגנלינג הדופמינרגי.
- טכניקה זו משלבת קיבוע מתח (voltage clamping) עם מדידות אמפרומטריות לדיוק משופר.
מטרת המחקר
- למדידת הובלה לאחור של דופמין בנוירונים תחת קיבוע פוטנציאל (voltage-clamped).
- לבחינת הקשר בין פעילות DAT לבין שחרור דופמין.
- לספק שיטה למחקר תפקודי של נוירונים דופמינרגים בזמן אמת.
השיטות שנעשה בהן שימוש
- בדיקת תקינות האלקטרודה הפירומטרית באמצעות דופמין.
- השגת הגבלה של תא שלם (whole cell patch) של הנוירון באמצעות פיפטת פאץ'.
- בקרת מתח התא באמצעות פיפטת הפאץ'.
- הקלטה של שחרור דופמין המתווך על ידי DAT באמצעות האלקטרודה הפירומטרית.
תוצאות עיקריות
- מדידה מוצלחת של שחרור דופמין במהלך קיבוע מתח (voltage clamping).
- הדגמה של השפעת חוסמי DAT על הובלת דופמין.
- מתן תובנות לגבי מנגנוני הבקרה של הובלת דופמין.
- תיקוף של השיטה לחקר דינמיקה של דופמין נוירונלי.
מסקנות
- הטכניקה מודדת ביעילות הובלה הפוכה של דופמין.
- בקרה סימולטנית של המתח משפרת את ההבנה של תפקוד ה-DAT.
- ניתן להחיל שיטה זו על מחקרים נוספים בנושא סיגנלינג דופמינרגי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית ביצועית
שיטה זו מאפשרת מדידה ישירה של זרימת דופמין החוצה דרך נשא הדופמין תחת בקרת מתח, ובכך מספקת תובנה מכניסטית לגבי תפקוד הנשא הרלוונטי לגילוי תרופות נוירו-פסיכיאטריות. באמצעות בידוד שחרור המתווך על ידי DAT בזמן אמת, היא תומכת בתיקוף מטרה ומפחיתה סיכונים בהיפותזות לגבי סיגנלינג דופמינרגי במודלים של מחלה. הגישה מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי קישור פעילות הנשא לדינמיקה של מוליכים עצביים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן את מנגנון השחרור (efflux) של נשא הדופמין כדי לתקף מעורבות תפקודית של המטרה בנוירונים חיים.
- ערך תפעולי: מאפשר הקלטה אלקטרופיזיולוגית ואמפרומטרית בו-זמנית כדי להקרין את פוטנציאל הממברנה עם זרימת דופמין המתווכת על ידי הנשא.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר קריאות כמותיות של זרם חמצוני ברזולוציית זמן, המשקפות שחרור דופמין התלוי ב-DAT תחת מדרגות מתח מבוקרות.
- ערך תפעולי: קובע פורמט בדיקה הניתן לשחזור למדידת תפירה (efflux) המתווכת על ידי נשאים, התומך בסינון תרכובות עבור מודולטורים של DAT.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקשר את פעילות ה-efflux של DAT להומיאוסטזיס של דופמין חוץ-תאי, ובכך מספק מידע למודלים של מחלות שבהן מעורבת תפקוד לקוי של הנשא.
- ערך תפעולי: מספק מערכת רלוונטית למחלה להערכת הפרעות גנטיות או פרימקולוגיות בתפקוד נשאי הדופמין.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של גילוי מוקדם על ידי כך שהיא מאפשרת הפחתת סיכונים מכנית של מטרות לנשאי דופמין לפני מאמצים לזיהוי מובילים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות לגבי מנגנוני היפוך של נשאי חלבון ובהבהרה של מסלולים בנוירונים דופמינרגיים.
- סריקה: מספק פלטים כמותיים המוכנים לבדיקה להערכת השפעות של תרכובות על זרימה החוצה (efflux) המתווכת על ידי DAT.
- אנליטיקה: מספקת מדידות סימולטניות של זרם תא שלם ומדידות אמפרומטריות לבידוד אותות ספציפיים ל-DAT באמצעות חיסור פרמקולוגי.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית על ידי מידול של הפרות בוויסות דופמין במערכות נוירונליות מבוקרות מתח.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר להערכת תפקוד נשאי חלבון במודלים נוירונליים מרובים או בהקשרי מחלה שונים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתיקוף המטרה על ידי מדידה ישירה של שחרור דופמין המתווך על ידי א fluxo (efflux) תחת בקרת מתח פיזיולוגית.
- ערך תפעולי: מקדם סטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות סנכרון בין patch clamp לאמפרומטריה, ובכך מפחית את השונות במדידות של זרימת מוליכים עצביים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות go/no-go על ידי הבהרת מנגנון הפעולה של הנשא, ובכך מפחית את שיעור הנשירה בשלבים מאוחרים עקב אי-הבנה מכניסטית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של תרכובות המכוונות ל-DAT בהתאם לניהול סיכונים, בהתבסס על נתוני מודולציה פונקציונלית של efflux.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באלקטרופיזיולוגיה, אמפרומטריה ותרביות נוירונליות כדי לשמור על תקינות האלקטרודות ועל נאמנות האות.
- תלוי במכשור בעל רעש נמוך, הכולל מניפולטורים הידראוליים, שני מגברי Axopatch 200B ואלקטרודות סיבי פחמן להקלטה סימולטנית.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי מתח ושיטות חיסור אנטגוניסטים כדי להבטיח השוואתיות בין הניסויים.
- כולל שיקולי התאמה למודלים נוירונליים שונים, במיוחד בנוגע לרמות ביטוי של טרנספורטר דופמין ולבריאות הממברנה.
- כולל מגבלות מעשיות כגון חמצון של תמיסת דופמין, הדורש טיפול מגן ותיקוף בסיס (baseline validation) לפני ואחרי הניסויים.
