הפרוטוקולים מכתים עבור איי הלבלב אדם
23 במאי 2012
סרט הווידאו הזה מדגים נהלים ואפיון של איים הלבלב אדם באמצעות hematoxylin ו eosin (H & E) ו אימונוהיסטוכימיה (IHC). סעיפים הלבלב מן הראש, הגוף, באזורים הזנב מוכתמות על ידי שני H & E ו-IHC לקבוע הרכב האנדוקרינית איון (אינסולין, גלוקגון, והלבלב פוליפפטיד), שכפול תאים (Ki67), וכן מחלחל דלקתיות (H & E, CD3). האזור אונקלי הוא מקומי באמצעות IHC של הלבלב פוליפפטיד.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לאפיין איים בלבלביים אנושיים באמצעות צביעת המטוקסילין ואוזין ואימונוהיסטוכימיה. זאת על ידי יצירת חיתוכים סדרתיים מדגימת לבלב הטמיעה בבלוק פאראפין. החיתוכים מונחים לאחר מכן על סליידים תוך שמירה על כיוונם המקורי.
חלק מהשקופיות נצבעות ב-hematin ו-eoin בעוד ששאר השקופיות נצבעות באמצעות אימונוהיסטוכימיה; השלב הסופי הוא סריקת השקופיות הצבועות וארגונן לפי מקרה. בסופו של דבר, ניתן להעלות תמונות אלו למסד נתונים פתולוגי מקוון שבו יוכלו להיסקר על ידי חוקרים אחרים בתחום. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שהשקופיות נצבעות בסדרה תוך שמירה על אוריינטצייתן המקורית.
את הפרוצדורה ידגימו לינדה סניידר, טכנולוגית היסטולוגיה, אמילי מונטגומרי, מדענית ביולוגית, ותיפני היפו, טכנאית מעבדה במעבדתי. ראשית, הגדירו את אמבט המים והמיקרוטום על פי הפרוצדורות הסטנדרטיות למיקרוטומיה של פראפין. לאחר מכן, סמנו שקופיות טעונות חיובית עם מספר המקרה, אזור הלבלב ומספר השקופית.
לאחר שהכל מוכן, מקמו את בלוק הפרפין במלחצי המיקרוטום כאשר התווית של הקסטרה פונה לצד שמאל. בהתאם לנהלי המיקרוטומיה הרגילים, בצעו חיתוכי בלוק עד לחשיפה אחידה של הרקמה. ברגע שהרקמה נחשפת באופן שווה, הפקו סרט של חתכים סדרתיים בעובי של כ- ארבעה מיקרון.
דרושים שלושה עד שישה סריקות בהתאם למספר הצביעות הראשוניות הנדרשות. לאחר מכן, הפר את סריקות הסרט. הרם כל סריקה לפי הסדר והניח אותה על זכוכית.
רשמו את מספר החתך בעיפרון. אם חתך אינו שמיש, דלגו על מספר זה והמשיכו במספור החתכים לפי הסדר המדויק. הקפידו לשמור על אותה אוריינטציה של החתך על השקופית כפי שנמצאה בקסטרה, כאשר תווית השקופית מופנית שמאלה.
בשלב הבא, הניחו את השקופיות במגש לשקופיות והניחו להן להתייבש למשך הלילה. בטמפרטורת החדר, אטמו מחדש את פניו של בלוק הפרפין בשכבה דקה של פרפין כדי לשמר את הרקמה, ושמרו אותו בטמפרטורת החדר או במינוס 20 degrees Celsius. חזרו על הליך זה עבור הדגימה הבאה.
חשוב לשמור על מספור החתכים הסדרתיים בכל רמה, כפי שמוצג לעיל עבור צביעת H&E. הניחו את השקופית הראשונה מכל בלוק במגש שקופיות, ולאחר מכן הניחו את המגש בתא הראשון של צובע השקופיות האוטומטי. בחרו בתוכנית HE הסטנדרטית והתחילו בתהליך הצביעה.
עם סיום הצביעה, הוציאו את השקופיות מהצובע האוטומטי והניחו אותן במנדף לצורך הנחת זכוכית כיסוי. הניחו זכוכית כיסוי על כל שקופית באמצעות טכניקות סטנדרטיות. לבסוף, סמנו את השקופיות באמצעות תווית מודפסת והניחו להן להתייבש לחלוטין במנדף.
התחילו בהגדרת צובע האוטומט ובpreparation של כל الريאגנטים הדרושים. בחרו בתוכנית Daco עבור צביעות כפולות. הזינו את מספר השקופיות ואת הטיפול שכל אחת מהן תקבל.
טענו את כל הרכיבים למכשיר הצביעה האוטומטי בהתאם להמלצות היצרן. לאחר מכן, הכינו TBST וציטראט, תמיסות בופר, נוגדנים ורכיבים נוספים הדרושים לפרוצדורה. בצעו דפרליזציה לשקופיות על ידי השרייתן בקסילן למשך חמש דקות.
אין להניח לשקופיות להתייבש, שכן הדבר יוביל לרקע מוגבר ולצביעת נקבים עודפת בזמן שביצוע ה-depa. שפו באפר ציטראט לתוך מכשיר אידוי (steamer) כדי לחממו לפני השימוש. לאחר מכן, העבירו את שקופיות ה-depa לסדרה של שטיפות אתנול.
שטפו את השקופיות פעם אחרונה במים דאיוניים. העבירו את השקופיות לבফার הציטרט שחומם מראש והמתינו 30 דקות בתנאי אידוי. בתום פרק זמן זה, העבירו מיד את השקופיות לאמבט מים בטמפרטורת החדר עד לקירור מלא.
לאחר הקירור, העבירו את השקופיות לסלסלאות של צובע האוטומטי Dayco, תוך הקפדה על שמירת הרצף הנכון. לבסוף, הפעילו את תוכנית הצביעה הכפולה שנטענה קודם לכן. עם השלמת תוכנית הצביעה הכפולה, הוציאו את השקופיות מהצובע האוטומטי והניחו להן להתייבש למשך שעה אחת לפחות לפני ביצוע דהידרציה.
כדי להמשיך בהתייבשות, העבירו אותן ל-80%ethanol למשך דקה אחת. המשיכו בייבוש השקופיות על ידי השריה ב-95%ethanol ולאחר מכן ב-100%end. לבסוף, טבלו והחזיקו את השקופיות ב-xylene למשך דקה אחת.
הצמידו מיד את הזריגות באמצעות כיסויי זכוכית תוך שימוש ב-cyto seal להשלמת הפרוצדורה. הדפיסו תוויות המכילות את פרטי המקרה, כולל האיבר ומספר הבלוק, סוג הצביעה והתאריך. הניחו תווית על כל זריגה לצורך סריקת השקופיות הצבועות.
הניחו אותם על מגש הסורק ופעלו לפי הפרוטוקולים הסטנדרטיים. ארכבו את השקופיות הצבועות בטמפרטורת החדר ואת השקופיות שנותרו ללא צביעה במינוס 20 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. לבסוף, ארגנו את התמונות הצבועות לפי תורם וסוג הרקמה שנצפה.
להלן דוגמה לצביעה של KI 67 ואינסולין הן בהגדלה נמוכה והן בהגדלה גבוהה. תמונות של חתכי הלבלב הצבועים מועלות למסד נתונים פתולוגי מקוון היוצר ביו-בנק וירטואלי. באמצעות מסד נתונים זה, חוקרים יכולים לגשת במהירות למידע הדרוש למחקר על סוכרת מסוג 1.
לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן ההכנה והצביעה של סנשצים (slides) באיכות גבוהה מלבלב אנושי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
סרטון זה מדגים פרוצדורות לאפיון של איים לבלב אנושיים באמצעות צביעת hematoxylin and eosin (H&E) ואימונוהיסטוכימיה (IHC). טכניקה זו מאפשרת להעריך את ההרכב האנדוקריני של האיים, רפליקציית תאים והסננות דלקתית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- אנדוקרינולוגיה
- היסטולוגיה
רקע
- איי לבלבל אנושיים ממלאים תפקיד מכריע במטבוליזם של גלוקוז.
- אפיון הרכב האיים חיוני להבנת מחלת הסוכרת.
- H&E ו-IHC הן טכניקות סטנדרטיות לניתוח רקמות.
- שמירה על האוריינטציה המקורית של השקופיות קריטית להערכה מדויקת.
מטרת המחקר
- לאפיין איי לבלבל אנושיים.
- לקבוע את ההרכב האנדוקריני של האיים.
- להעריך רפליקציה של תאים ותגובות דלקתית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת חתכים סדרה מדגימות לבלב שטומנו בפרפין.
- צביעת חתכים ב-H&E וב-IHC.
- סריקת שקופיות צבועות לצורך ניתוח.
- ארגון תמונות לפי מקרה להעלאה למסד הנתונים.
תוצאות עיקריות
- זיהוי אינסולין, גלוקגון ופוליפפטיד לבלב באיים.
- הערכה של שכפול תאים באמצעות צביעת Ki67.
- הערכה של חדירות דלקתיות באמצעות צביעת H&E ו-CD3.
- מיקום מוצלח של האזור המקולף (uncinate region) באמצעות IHC.
מסקנות
- השיטה מספקת אפיון מקיף של איים לבלביים.
- שמירה על הכיוון המקורי של הפלח משפרת את דיוק הניתוח.
- התוצאות תורמות להבנת התפקוד הלבלבי במצב בריאות ובמחלה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
תהליכי עבודה סטנדרטיים של היסטופתולוגיה עבור איים של תאי בטא בלבלב אנושי מאפשרים אפיון הדיר של תאים אנדוקריניים, ובכך תומכים בתיקוף מטרות במחקרים על סוכרת. באמצעות שימור אוריינטציית חתכים סדרתיים ויצירת תמונות דיגיטליות של השקף כולו, השיטה מקלה על שיתוף נתונים בין-פונקציונלי ועל ביו-בנקאיות לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים של טיפולים המכוונים לאיים. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי במודלים פרה-קליניים על ידי אספקת נתונים כמותיים בעלי רזולוציה מרחבית על הרכב האיים, שכפולם והסננת חיסונית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות היסטופתולוגיה קפדנית ומיקום אימונולוגי של תאי איים אנדוקריניים.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי אפיון מורפולוגיית האיים, גודלם, צפיפותם והרכב התאים האנדוקריניים באמצעות צביעות H&E ו-IHC.
- ערך ניבוי: מסייע במיון תיקי פיתוח על ידי הערכת שכפול איים ותאים אפופטוטיים באמצעות Ki67 וסמני פרוליפרציה אחרים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: הכנה של מערכות ביולוגיות עוברי-תיקוף עבור תהליכי עבודה המשכיים, באמצעות עיבוד סטנדרטי של לבלב אנושי לאזורים מוגדרים (ראש, גוף, זנב) ולחתכים רוחביים.
- ערך תפעולי: מענה לסטנדרטיזציה ושחזוריות של בדיקות באמצעות מספור וסימון אלפביתי של תתי-חתכים על בסיס גודלם, לצורך ניתוח מלא של חתכים רוחביים.
- ערך הפלטפורמה: הדגשת המוכנות לסריקה ויכולת ההרחבה באמצעות תמונות דיגיטליות של שקופיות שלמות, המאורגנות במסד נתונים פתולוגי מקוון הנגיש ליותר מ-200 חוקרים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: דן ברלוונטיות למחלה על ידי הערכת איים לזיהוי דלקת, פיברוזיס, עמילואיד וחדירה של תאי T באמצעות צביעות H&E ו-CD3.
- ערך תפעולי: מתאר את הרצף משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני על ידי הערכת המרכיבים האנדוקריניים והאקסוקריניים, כולל פתולוגיה דוקטולרית ונאופלזיה.
- קידום מותאם סיכון: מתמקד בהפחתת סיכונים חזויה על ידי אפיון נאופלזיה תוך-נישבתית בלבלב והקשר שלה למערכת הנישבים.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline) וזרימת עבודה
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף מוקדם של מטרות ועד להערכה פרה-קלינית, על ידי מתן אפשרות לביצוע חיתוכים סדרתיים, צביעה סטנדרטית ובנקאות ביולוגית דיגיטלית של רקמת לבלב אנושית.
- ביולוגיה של גילוי: תמיכה בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים באמצעות היסטופתולוגיה ומיקום אימונולוגי של איים לבלביים ותאים אנדוקריניים.
- סריקה: הבטחת מוכנות ושחזוריות של הבדיקה על ידי שמירה על אוריינטציה מקורית של השקופיות במהלך חיתוך סדרתי וצביעה בסדרות.
- אנליטיקה: הדגשת מדידות כמותיות של שטח האיים, מספרם, הרכב התאים האנדוקריניים, שכפול וחדירות של T-cells באמצעות H&E ו-IHC כדי לאפשר השוואה בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: קישור לרציפות פרה-קלינית באמצעות הערכת עמילואיד באיים, פיברוזיס וחדירות דלקתיות הרלוונטיות לפתוגנזה של סוכרת מסוג 1.
- שימוש חוזר ארגוני: הגדרת השיטה כיכולת הניתנת לשימוש חוזר באמצעות מאגר פתולוגיה מקוון המאפשר שיתוף נתונים מהיר ובחירת בלוקים עבור חיתוכים סדרתיים בפרפין או בהקפאה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון ניבוי, תיקוף מטרה, והפחתת עמימות מכניסטית בהרכב האנדוקריני של האיים ובאינטראקציות חיסוניות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה של חיתוך סדרתי, צביעה וארכוב דיגיטלי של שקופיות.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go), יעילות הון והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים באמצעות זיהוי מוקדם של פתולוגיה באיים ומצב השכפול.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף והחלטות קידום מותאמות סיכון, המבוססות על מורפולוגיה כמותית של האיים, צפיפות ופנוטיפים של תאים אנדוקריניים.
שיקולים ליישום
- מומחיות מדעית נדרשת בהיסטו-טכנולוגיה, אימונוהיסטוכימיה ותהליכי עבודה של פתולוגיה דיגיטלית.
- צרכי תשתית אנליטית וציוד, כולל מיקרוטום, צובע אוטומטי, סורק שקופיות וגישה למסד נתונים פתולוגי מקוון.
- דרישות לסטנדרטיזציה בין-צוותית עבור סימון שקופיות, מספור חתכים ושמירה על אוריינטציה בין צוותי ההיסטולוגיה והדימיון.
- שיקולי התאמה בין מערכות מודלים, במיוחד עבור יישום עיבוד אזורי סטנדרטי (ראש, גוף, זנב) ללבלב שאינו אנושי.
- מגבלות מעשיות כוללות שונות ברקמות מתורמי איברים ואת הצורך בתיקוף אופטימלי של נוגדנים עבור צביעת IHC מולטיפלקס.
