רוק הדגימה האדם Peptidome ילידים באמצעות בדיקה Lollipop-Like Ultrafiltration: פשט ולשפר גילוי פפטיד של ספקטרומטריית מסה קלינית

מחקר זה של פפטידים ברוק משתמש בגשש אולטרה-פילטרציה דמוי סוכרייה על מקל (lollipop), ולאחריו ניתוח ישיר באמצעות ננו-LC-LT-Q מספקטרומטריית מסות. ראשית, הרכיבו את גשש ה-LLUF באמצעות ממברנת פוליאתר-סולפון וצינור אתילן-פרופילן. לאחר מכן, אספו דגימות רוק ממתנדבים ועבדו אותן דרך גשש ה-LLUF לצורך דגימת הרוק.

לאחר מכן, עברו ישירות למספקטרומטריית מסות nano L-C-L-T-Q ונתחו את הנתונים מדגימות רוק עם ובלי טיפול ב probes של LLUF. בסופו של דבר, ניתן להשיג את הפפטידים ברוק על ידי ניתוח נתוני L-C-M-S-S והשוואת הפפטידים שזוהו בין שתי הדגימות. גישה זו, המשתמשת ב-probe לסינון אולטרה דמוי סוכרייה על מקל המשולב לניתוח ישיר באמצעות מספקטרומטריית מסות nano lc LTQ, מציעה יתרונות מרכזיים על פני שיטות אחרות, כגון עיכול חלבוני רוק לפפטידים.

בעקבות ניתוח ספקטרומטריית מסות, ה-LUF PRO מפשט ומנקה את הרוק, וכן משפר את זיהוי ה-MS של פפטידים ברוק שלם ליישום קליני. השתמש בדבק אפוקסי כדי לאטום את ממברנות הפוליאתר על גבולותיהם של כפות הפוליפרופילן המשולשות. לאחר מכן, חבר צינור Teflon fluorinated ethylene propylene ליציאה הגלילית של המשולש.

סטריליזציה של משוט פוליפרופילן; סטריליזציה של הגששים ב-70% alcohol למשך לילה. כדי להערכת אטימה תקינה, טבול את גששי ה-LLUF בתמיסת Blue dextran בריכוז 50 mg/mL למשך שעתיים. אשר את היעדרו של Blue dextran בדגימות שנאספו.

גייסו מתנדבים בריאים בגילאי 20 עד 40. לאחר שטיפת הפה במים, בקשו מהנבדק לירוק דגימות של רוק שלם לתוך כלי מקורר על קרח. אגדו את כל הדגימות ושמרו אותן על קרח.

מיד לאחר האיסוף, עברו לחדר בטמפרטורה של 4 °C עם 200 µL רוק לצורך דגימה באמצעות גששים מסוג LLUF. כעת, השרו את ממברנת הפוליאתר ברוק אנושי בתוך צלחת תרבית. צרו לחץ שלילי על ידי משיכת בוכנת מזרק כדי לדמות תהליך של אולטרה-פילטרציה לדגימה מהרוק.

בשלב הבא, קבעו את ריכוזי החלבון. הכינו דגימות של חלבון מרוק בריכוז של one microgram per microliter לצורך אנליזה באמצעות nano lc mass spectrometry. לאנליזת הדגימות, אנו משתמשים במערכת exigent nano lc המחוברת באופן מקוון למספקטרומטר מסות Finnegan LTQ. תחילה, טענו five microliters של דגימות רוק שלא עברו עיכול לעמודת הלכידה (trap column) של מערכת ה-nano lc באמצעות הדגימה האוטומטית (auto sampler).

לאחר שלב השטיפה, העבירו את השסתום והזרים גרדיאנט ליניארי של 0% עד 50% של בופר B למלכודת ולעמודת ההפרדה C 18. באמצעות מצב ה-data dependent של Excalibur, אספו ספקטרא של ms ms עבור ארבעת יוני ה-MS החזקים ביותר בעלי עוצמה הגבוהה מ-1 × 10⁴. עבור כל דגימה, בצעו הרצות כפולות של שלוש הכנות נפרדות ושונות.

לאחר מכן, ייבא את קובץ הנתונים למערכת sequester sorcerer two ובחר בחיפוש מול מאגר חלבונים אנושי מתאים של NCBI תוך שימוש ב-non enzyme specificity. לאחר החיפוש ב-sequester, התוצאות מסוננות, מאומתות ומוצגות באופן אוטומטי ב-peptide profit וב-protein profit בהתבסס על תוצאות ה-sequester. ה-Peptide profit מעריך ציון הסתברות P מקיף לכך שהשיוך של הפפטיד הוא נכון לעומת שגוי, ומזהה גם מידע נוסף על כל רצף פפטידי.

Protein profit מחשב ציון הסתברות מאפס עד אחד עבור כל חלבון על בסיס פפטידים שהוקצו לספקטרום Ms.Ms. חלק זה קובע את היכולת של גשושי LLUF להסיר חיידקים מהפה לצורך תרבית זיהוי חיידקית, כאשר דגימות הרוק נלקחות לפני ואחרי איסוף באמצעות גשוש LLUF על פלטות agar לבדיקת חיידקים אירוביים. השתמש בפלטות agar מסוג LB ללא אנטיביוטיקה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך יום אחד, ועבור חיידקים אנארוביים, השתמש ב-gas pack לצורך התרבית.

את הדגימה זרעו על מצע Bru broth ועל צלחות אגר תחת תנאי אנאירובי בטמפרטורה של 37 °C למשך יום אחד. ייצורם של התקני אולטרה-פילטרציה דמויי סוכרייה על מקל (lollipop) מקל על דגימת רוק בסביבה פהית מדומה. במערכת זו, ממברנת פוליאתר בעלת מטען שלילי עם סף משקל מולקולרי של 30 kilodaltons מודבקת למחבט פוליפרופילן וממוקמת לפני גשושית ה-LLUF כדי לסנן חלבונים גדולים יותר ברוק.

על מנת לחקות את הסביבה הפהית האנושית, ספוג מרווה ברוק באמצעות מזרק. הרוק מסונן ונאסף דרך הצינור המחובר. השוואה בין כרומטוגרמות lc של הרוק לפני ואחרי דגימה ב-LLUF הובילה לזיהוי של פפטידים מקומיים ברוק באמצעות ספקטרומטריית מסות nano L-C-L-T-Q.

מכיוון שקרומטוגרמות דיפרנציאליות אלו מופקות ללא עיכול כימי או אנזימטי, הן מפשטות את הכנת הדגימות למטרות קליניות. בדגימה זו, לאחר ביצוע LLUF להבהרה של הרכבי החלבון השונים, זוהו 131 פפטידים ברוק שלא עבר עיכול.

פפטידים אלו הם מקטעים המופקים מחלבונים שונים עשירים בפרולין. אקטין, אלפא-עמילאז, אלפא-1-גלובין, בטא-גלובין, היסטון 1, קרטין, מיוצין 1, קולטן אימונוגלובולין פולימרי, סרין ו-S100. 26 פפטידים ייחודיים שזוהו ברוק לאחר סינון באמצעות גשושים מסוג LLUF הם מקטעים המופקים בעיקר מחלבונים שונים עשירים בפרולין.

פפטיד זה, שנגזר מאלפא-עמילאז, זוהה באופן בלעדי בדגימת רוק שלא נאספה באמצעות פרוbes של LLUF, דבר המדגים את יכולתן של פרוbes של LLUF להסיר חלבונים גדולים. באופן מרתק במיוחד, לאחר הסרת החלבונים הגדולים, ניתן היה לזהות מספר פפטידים בעלי רצפים בדגימת הרוק שנאספה באמצעות פרוbes של LLUF; בייחוד זוהו דגימות עם קצוות C עשירים בפרולין לאחר סינון אולטרה באמצעות פרוbes של LLUF. כעת צריכה להיות לכם הבנה טובה כיצד להשתמש ב-A-L-L-L-L-U-F PRO עבור דגימות רוק פשוטות לניתוח מסה.

ניתוח משופר הוא חשוב מאוד לאיסוף רוק פשוט תחת תנאים עקביים. לאחר השתלטות על הפרוטוקול, אני מאמין שניתן לבצע טכניקה זו כראוי בתוך שלוש שעות. גישה זו, המשתמשת בProbe לסינון אולטרה (ultra filtration) דמוי סוכרייה על מקל המשולב עם ניתוח ישיר ב-nano L-C-L-T-Q-M-S, spectrum chain, מקלה על יישומים קליניים עבור סמנים ביולוגיים (biomarkers) באבחון מחלות בבני אדם.