NADH Fluorescence הדמיה של Biventricular מבודדת עבודה לבבות ארנב
24 ביולי 2012
המטרה היא לפקח על המדינה חמזור המיטוכונדריה של לבבות בודדים בהקשר של preload פיזיולוגי ולחצים afterload. הלב biventricular לעבוד במודל ארנבת מוצג. רזולוציה גבוהה spatiotemporal הקרינה הדמיה של NADH משמש כדי לפקח על מצב חמזור המיטוכונדריה של הרקמה epicardial.
המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לחקור את חילוף החומרים (metabolism). באמצעות דימות NADH בהכנה של לב פעיל, הדבר מושג תחילה על ידי בידוד לב של ארנבת. השלב השני של הפרוצדורה הוא קנולציה מוצלחת של כל ארבעה חללי הלב כדי להשיג מודל של לב פעיל.
השלב הסופי הוא הגדרת ציוד הדימוי ואיסוף נתוני NADH בקצבי קצב שונים. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות שינויים מטבוליים של הלב באמצעות דימוי של NADH פלואורסצנטי. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו ה-lanor retro profusion, הוא שהלב פועל במצבו הפיזיולוגי עם זרימה בכיוון הנורמלי, כאשר הלב מספק בעצמו את הלחץ הדרוש לפרפוזיה קורונרית.
שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח באלקטרופיזיולוגיה ובמנגנונים של הפרעות קצב קטלניות. הדבר מתבצע באמצעות אספקת מודל פיזיולוגי לבחינת הקשר בין מטבוליזם של זרימה כלילית לבין פעילות חשמלית. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מאחר ששלבי הקניולציה של כלי הדם ולשבת הלב הם קשים ללמידה.
טכניקה לא נכונה עלולה לגרום לנזק ללב ולסכן את המשך הניסוי. לפני ביצוע הניסוי, יש לשטוף את כל השפופרות בתאי מערכת הלב הפועל במים מזוקקים, ולאחר מכן להוציא את המים מהמערכת באמצעות הפעלת המשאבות. יש להוסיף מסנני ממברנת תאית בקו עם משאבת הפרפוזיה של ה-LOR, משאבת הפרפוזיה של הלב השמאלי ומשאבת הפרפוזיה של הלב הימני.
לאחר הוספת ה-perfuse eight למערכת, בצע כיול שתי נקודות עבור כל חיישן לחץ. הפעל את אמבט המים המחומם במחזוריות, המחמם את הצינורות עם מעטפת המים ואת מחליפי החום. הפעל את אמבט המים המשמש לחימום ה-PERFUSE eight.
הפעילו את המשאבות המזרימות את ה-PERFUSE eight בלולאה סגורה, והפעילו את מיכל הסירקולציה כדי לחממנ את ה-Perfuse. Eight. ודאו שהחממנן המיקרו-סיבי או מסנני ההמופילטרים מספקים 95% oxygen ל-perfuse eight בלחץ של 80 kilopascals. לבסוף, ודאו שמחליפי החום שומרים על טמפרטורת ה-perfuse במחזור.
בטמפרטורה של 37 °C, התחילו את כריתת הלב על ידי הגדרת מערכת עבודת הלב לפעולה בלחץ קבוע. מצב LRF. הגדירו את הלחץ של חסימת האביון בין 50 ל-60 לאחר הרדמת ארנב.
הזריקו פנטובארביטול והפרין לווריד האוזן השולי או לווריד הספנוס הלטראלי בחלק הפנימי של הגפה האחורית. ברגע שהארנב אינו מגיב לרפלקס כאב, פתחו במהירות את חלל בית החזה. חתכו את הפריקרדיום, קבעו את האורטה באמצעות תסמיך והוציאו את הלב והריאות.
הריאות נשארות מחוברות כדי להקל על בידוד הוורידים הראתיים. לאחר מכן, מלאו מזרק ב-60 milliliters של פתרון per F eight ו-200 units של heparin. חברו קנולה של 5 millimeter ובצעו קנולציה של האביון (aorta).
קבע את האאורטה לקנולה באמצעות תפרי משי בגודל 0. לאחר מכן, לחץ באיטיות על המזרק כדי לשטוף את הדם דרך הלב. הגדר את מערכת הלב הפועל על ידי חיבור הלב לבלוק האאורטלי.
התקרבו למחבר בזווית אלכסונית ואפשרו ל-Perfuse eight לטפטף בעדינות מהמחבר אל תוך הקנולה בעודו מחובר. פעולה זו מונעת חדירת אוויר לאורטה, ובכך מונעת תסמימות כלי דם כליליים בזמן שהלב עובר פרפוזיה בלחץ קבוע במצב L endorf.
הסיר את השומן ורקמת החיבור ואתר את כלי הדם הבאים: vena cava inferior ו-superior, וריד ה-aose, העורק הריאתי והורידים הריאתיים. לאחר מכן, בצע ליגציה ל-superior vena cava.
חתכו את העורק הריאתי ממש מתחת לנקודת הפיצול לעורקים הריאתיים הימני והשמאלי. כלי הדם הנותרים הם הוורידים הריאתיים. קבצו אותם בין הלב לריאות וקשרו את כולם באמצעות תפר אחד.
דבר זה קריטי משתי סיבות. ראשית, קשירת הכליים המחוברים לריאות תבטיח שלא תהיה דליפה לאחר השלמת הקנולציה. ושנית, חשוב לבודד את שתי הוורידים החלולים (VNA cavas) לקנולציה מאוחרת יותר.
כעת הוציאו את הריאות. גזרו חור בגודל מתאים בפינה של הנספח של העלייה השמאלית וודאו שהוא מלא ב-perfuse eight. לאחר מכן, בצעו קנולציה לנספח בעוד הקנולה מלאה לחלוטין ב-perfuse eight.
לאחר מכן, תוך כדי החזקת הרקמה, תפרו את הקנולה לאוזניק. הרקמה של אוזניק שמאלי היא עדינה ביותר ועלולה להיקרע בקלות. לכן, חשוב לבצע את הקניולציה של העליה השמאלית בניסיון הראשון, שכן אחרת הדבר עשוי שלא להיות אפשרי.
הפעל את משאבה מספר שתיים כדי לספק זרימה לעליה השמאלית. הגדר את הpreload לערך שבין 2 ל-6 tor לאורך כל הניסוי. ייתכן שיהיה צורך לכוון את הלחץ.
שמרו על לחץ הנמצא בטווח של שני מילימטרים מהלחץ המטרה. כעת העבירו את הלב למצב לב פעיל (working heart mode) על ידי כיבוי רגעי של משאבה מספר אחת, משאבת ה-langor. הנמיכו את הלחץ האאורטלי ל-10 mmHg ואז העלו אותו לאט לטווח של 80 עד 100 mmHg.
דבר זה מאפשר למסוע האורטלי להיפתח ולתפקד כפי שהיה קורה בתנאים פיזיולוגיים נורמליים. הגדרו את לחץ העומס האחורי הסופי לערך שהוא בערך 20% פחות מלחץ ה-LV השיא, באמצעות קנולה המחוברת ישירות למערכת.
החדירו קנולה לעלייה הימנית דרך ה-inferior vena CVA ותפרו את הקנולה לווריד. הימנעו מהחדרת בועות אוויר. הפעילו את משאבה מספר שלוש, משאבת הצד הימני, כדי לספק זרימה לעלייה הימנית.
כוון את הלחץ לכ-three tor. לבסוף, בצע קניולציה של החדר הימני תוך מניעת חדירת אוויר, ותפר את הקניולה לעורק הריאתי. בכך הושלמה הקניולציה הביוונטריקולרית.
כעת עברו לרכישת האותות. הכניסו בזהירות את קטטר מתמר הלחץ לאורטה דרך קנולת האורטה. נווטו אותו בעדינות מעבר למסתם האורטלי ואל תוך ה-lv.
אות הלחץ של ה-LV יופיע כמצופה כאשר קצה הקטטר ממוקם כראוי. לאחר מכן, הקהלו בעדינות את אלקטרודת פוטנציאל הפעולה המונופזי gegen an the ventricular epicardium. ארטיפקט תנועה קל באות האלקטרודה הוא תקין.
בשלב הבא, מקמו אלקטרודת גירוי ביפולרית בעלייה הימנית כדי לקצב את הלב בהתאם למיקום שנקבע בתכנון הניסויי. התמקדו במצלמת ה-CCD באזור העניין של הלב. למצלמה צריכה להיות מחוברת מסננת פליטה.
כדי להעביר פלואורסצנציית NADH, כבו את תאורת הסביבה כדי להאיר באופן אחיד את האפיקרדיום באמצעות מקור אור UV בתחנת העבודה, אליה מחוברת המצלמה. הגדירו את התוכנה לרכישת תמונות בקצב של שני פריימים לשנייה. לאחר מכן, בחרו במצב עדכון חי (live update) כדי לנטר את עוצמת הפיקסלים הממוצעת בתוך אזור העניין (region of interest).
אם הפרפוזיה הייתה מספקת, רמות ה-NADH המיוצגות על ידי הפלואורסצנציה צריכות להיות נמוכות ויציבות על פני השטח של האפיקרד. כעת, הפסק את הניסוי כאשר הוא מסתיים. הוצא את הלב.
רוקנו את ה-PERFUSE eight ואת צינורות ומסבי המערכת באמצעות מים מזוקקים. שטפו את המערכת מדי פעם בתמיסת mucosal TM או בתמיסת מי חמצן מדוללת בהתאם לפרוטוקול המתואר. הלבבות הופעלו באורכי מחזור של בין 200 ל-400 פעימות לדקה.
ה-LVP הדיאסטולי היה בדרך כלל בין 0 ל-10 Tor, כאשר הלחץ האאורטלי הדיאסטולי המינימלי היה בקירוב 60 Tor. ה-LVP הסיסטולי בשיאו תלוי בלחץ המילוי וביכולת הכיווץ, ובאופן אופטימלי צריך להיות בין 60 ל-80 Tor; הלחץ האאורטלי המקסימלי וה-LVP המקסימלי צריכים להיות דומים מאוד. לפוטנציאלי פעולה מונופזיים האופייניים ללב של ארנב יש שלב דפולריזציה מהיר ושלב רפולריזציה מאפייני. פוטנציאלי פעולה הוקלטו בקלות מהתכשירים, אך לרוב נצפה בהם ארטיפקט תנועה קטן במהלך הדיאסטולה.
ערכי פלואורסצנציית NADH ממוצעים מאזור עניין בתוך הריבוע האדום נמדדו כדי לנטר שינויים במצב החמצון-חיזור המיטוכונדרי במהלך שלושה מחזורי קצב בפרקי זמן של 300, 200 ו-150 מילישניות, כאשר קצב הגירוי היה קרוב לקצב הסינוס. רמת ה-NADH הבסיסית נותרה קבועה יחסית ככל שאורך המחזור התקצר. מתחת ל-300 מילישניות רמות ה-NADH הבסיסיות עלו, כאשר העלייה הגדולה ביותר נרשמה ב-150 מילישניות; האות תנודתי עם ההתכווצות ותדירות התנודה תואמת את קצב הלב.
האמפליטודה של תנודות אלו הייתה תמיד נמוכה יותר מכל מגמה בלוח זמנים ארוך יותר שנגרמה על ידי איסכמיה או היפוקסיה. דימות פלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה של NADH של כל המשטח הקדמי ב-200 פעימות לדקה הייתה קבועה והומוגנית מרחבית ב-400 פעימות לדקה. רמות ה-NADH עלו באופן משמעותי לאורך כל האפיקרדיום.
נצפתה הגתרוגניות מרחבית משמעותית, כאשר העליות הגדולות ביותר התרחשו באזורי המחיצה של ה-RV וה-LV. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצעה בפחות מ-45 דקות אם היא מבוצעת נכון. בעת ניסיון ביצוע הליך זה, חשוב לזכור למנוע חדירה של בועות אוויר לאאורטה או לעלייה השמאלית לאחר הליך זה.
ניתן להשתמש בשיטות נוספות, כגון טעינת הלב בצבע רגיש למתח, כדי לענות על שאלות נוספות, כמו קישור בין הפעילות החשמלית למטבולית על פני השטח של הלב במהלך תרחישים פתולוגיים כגון איסכמיה מקומית לאחר התפתחותה. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בפיזיולוגיה של הלב לחקור הפרעות במטבוליזם ובהולכה של הלב בתנאים פתולוגיים תוך שימוש במודל רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית.
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה לניטור מצב החמצון-חיזור (redox) המיטוכונדריאלי בלבבי ארנב מבודדים תחת לחצי preload ו-afterload פיזיולוגיים. באמצעות דימוי פלואורסצנציה ברזולוציה גבוהה של NADH, חוקרים יכולים להבחין בשינויים מטבוליים בלב.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- פיזיולוגיה קרדיווסקולרית
- דימות מטבולי
- אלקטרופיזיולוגיה
רקע
- המחקר מתמקד במטבוליזם של הלב.
- דימות NADH מספק תובנות לגבי תפקוד מיטוכונדריאלי.
- מודל לב פועל מאפשר תנאים פיזיולוגיים במהלך הניסוי.
- הטכניקה שואפת לתת מענה לשאלות הקשורות לזרימה כלילית ולפעילות חשמלית.
מטרת המחקר
- לניטור מצב החימצון-חיזור (redox) המיטוכונדריאלי של לבבות מבודדים.
- לביסוס מודל פיזיולוגי לחקר מטבוליזם של הלב.
- לבחינת הקשר בין זרימה כלילית לבין הפרעות קצב לב.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד לב ארנב וקנולציה של חלליו.
- הקמת ציוד דימות לאיסוף נתוני NADH.
- שמירה על תנאים פיזיולוגיים במהלך פרפוזיה של הלב.
- שימוש בדימוי פלואורסצנציה להערכת שינויים מטבוליים.
תוצאות עיקריות
- ניטור מוצלח של מצב החמצון-חיזור המיטוכונדריאלי בזמן אמת.
- הדגמה של שינויים מטבוליים בקצבי קצב שונים.
- תיקוף של מודל הלב הפועל למחקרים פיזיולוגיים.
- תובנות לגבי הקשר בין המטבוליזם לפעילות חשמלית.
מסקנות
- השיטה מספקת גישה אמינה לחקר חילוף החומרים בלב.
- היא משפרת את ההבנה של המצב הפיזיולוגי של הלב.
- הטכניקה יכולה לסייע בחקירת הפרעות קצב קטלניות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
דימות פלואורסצנציה של NADH ברזולוציה גבוהה בלבבי ארנב פועלים דו-חדריים מאפשר הערכה כמותית וישירה של מצב החמצון-חיזור (redox) המיטוכונדריאלי תחת תנאי preload ו-afterload רלוונטיים פיזיולוגית. גישה זו מספקת ביטחון חזוי למחקרים מטבוליים ואלקטרופיזיולוגיים, ותומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים בממשק שבין שלב הגילוי לשלב הפרה-קליני. השיטה משפרת את הרצף התרגומי עבור מסלולי מחקר של מטבוליזם לבבי והפרעות קצב.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשרת בחינה של מסלולים מטבוליים ותפקוד מיטוכונדריאלי במודל לב עם עומס פיזיולוגי.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי קישור המצב המטבולי לפלטים אלקטרופיזיולוגיים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מנגנוניים עבור יעדים של מטבוליזם לבבי והפרעות קצב.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מערכת מומחצת וניתנת לשחזור עבור דימוי כמותי של שינויים מטבוליים בתגובה לקצבי קוצביות מבוקרים.
- מאפשר סטנדרטיזציה של תנאי הבדיקה למדידות רדוקס מיטוכונדריאליות.
- תומך בסריקת התערבויות המשפיעות על מטבוליזם לבבי בתנאים קרובים לפיזיולוגיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה פלטי דימות מטבולית לפתולוגיות לבביות רלוונטיות למחלה, כגון איסכמיה והיפוקסיה.
- שומרת על תפקוד לבבי פיזיולוגי, ובכך תומכת בפיתוח ביומרקרים תרגומיים.
- מאפשרת קבלת החלטות על קידום מטרות מטבוליות ואלקטרופיזיולוגיות בהתאם לסיכון.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
שיטה זו מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר פרה-קליני על ידי אספקת פלטפורמה חזקה לבדיקת השערות ולקבלת מדדים מטבוליים כמותיים במערכת לבבית רלוונטית פיזיולוגית.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בחקירה מונחית-היפותזה של דינמיקה של חמצון-חיזור מיטוכונדריאלי במהלך עקה מטבולית או היפוקסית.
- סריקה: מספק פלטי פלואורסצנציה כמותיים וניתנים לשחזור של NADH לצורך ניתוח השוואתי בין תנאים ניסיוניים.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה בזמן אמת של המצב המטבולי וההטרוגניות המרחבית ברקמת לב.
- מחקר תרגומי: מסייע בהמשכיות מגילוי in vitro ועד לאישור פרה-קליני במודלים הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר למחקרי מטבוליזם ואלקטרופיזיולוגיה של הלב לאורך תוכניות מו"פ.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזיוי בתיקוף יעדים מטבוליים ואלקטרופיזיולוגיים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של זרימות עבודה בדימות מטבולי לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי הפחתת עמימות מכניסטית במחקרי מטבוליזם של הלב.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של תוכניות למטבוליזם של הלב והפרעות קצב.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בפיזיולוגיה של הלב, קניולציה כירורגית ודימות פלואורסצנציה.
- נדרש מיכשור ייעודי הכולל מערכות פרפוזיה, חיישני לחץ ומצלמות CCD ברגישות גבוהה.
- נדרש סטנדרטור בין-צוותי קפדני של פרוטוקולי הפרפוזיה והדימות.
- התאמה למינים אחרים או למודלים של מחלות עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- טיפול זהיר חיוני למניעת תסביכי אמבולת אוויר ונזק לרקמות במהלך הקניולציה.
