מדידת כמותית של Proteolysis מטריקס invadopodia בתיווך בקשרים יחידים ורבים תאיים

טכניקה סטנדרטית זו מייצרת כיסויים של זכוכית (cover slips) מצופים בג'לטין המסומן פלואורסצנטית, המתאימים לבדיקות כמותיות של פירוק מטריצה על ידי פודיה פולשנית (invadopodia). לאחר ציפוי הכיסויים בג'לטין המסומן פלואורסצנטית, זרעו את התאים וגדלו אותם לצורך פירוק המטריצה. לאחר מכן, קבעו וצבעו פלואורסצנטית את התאים עבור חלבונים מסמנים של פודיה פולשנית, רכשו את התמונות וכמתי את פירוק המטריצה.

תוצאות טיפוסיות יכולים להכמיר את ההבדלים בניוון המטריקס המתווך על ידי פודיה בין תאים עם מניפולציה דיפרנציאלית של גנים נבחרים או טיפול בחומרים פרמקולוגיים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן הכנת כיסויות זכוכית מצופות ג'לטין עם פלואורסצנציה הומוגנית היא קשה להשגה בשל ציפוי לא אחיד של ג'לטין פלואורסצנטי או טיפול לא נכון בכיסויות זכוכית מצופות ג'לטין. את הפרוצדורה ידגימו פרופ'סורית מחקר Karen Martin, עמיתת פוסט-דוקטורט Mandy Ammer וסטודנטים לתואר שני Elise Walk, Karen Hayes ו-Steve Markwell.

להכנת תמיססת מלאי לא מסומנת של 5% ג'לטין וסוכרוז, ערבבו את הג'לטין והסוכרוז ב-PBS והמיסו לחלוטין בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, אחסנו בטמפרטורה של 4 °C. המשיכו לניקוי זכוכית כיסוי המקריות.

חלקו כיסוי זכוכית בודד לכל באער של פלטת תרבית רקמות פלסטית בעלת 24 באערים, והוסיפו לכל באער 500 microliters של חומצה חנקית 20% והדגירו למשך 30 דקות. לאחר הסרת תמיסת החומצה החנקית, שטפו את כיסויי הזכוכית שלוש פעמים במים דה-יוניים. לאחר מכן בצעו ציפוי.

הוסיפו לכל זכוכית כיסוי 500 µL של poly-lysine בריכוז 50 µg/mL, והדגירו למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. הסירו את תמיסת ה-polylysine ושטפו שלוש פעמים עם PBS. ציפוי ב-Poly L lysine מסייע לציפוי אחיד ולהיקשרות של הג'לטין המסומן שמעליו. הניחו פלטות בעלות 24 בארות על קרח והוסיפו לכל בארה 500 µL של glutaraldehyde בריכוז 0.5% שהוכן טרי.

יש להדגיר את הפלטות על קרח למשך 15 דקות. בצעו שלושה שטיפות עם PBS קר, ולאחר מכן שאבו את כל שאריות ה-PBS לפני ציפוי הג'לטין. בינתיים, במהלך ההדגירה עם גלוטרלדהיד, שחזרו את הג'לטין המשורשר ל-Oregon Green 488.

בהתאם לפרוטוקול היצרן, חממו זאת ואת תמיסת המלאי של 5% gelatin sucrose שאינה מסומנת ל-37 °C. לאחר מכן, דללו 500 µL של ג'לטין מסומן בתוך ארבעה מיליליטרים של ג'לטין שאינו מסומן. טפטפו 100 µL מתערובת ה-4 88 gelatin המדוללת על כל זכוכית כיסוי.

השתמשו בכמות מספקת של ג'לטין כדי לצפות את כיסוי הזריקה ללא פריסה ידנית. חשוב להחזיק את תערובת הג'לטין המדוללת ב-4 88 בטמפרטורה של 37 מעלות במהלך תהליך הציפוי כדי למנוע הת굳נות מוקדמת. כמו כן, משלב זה ואילך, שמרו את כיסויי הזריקה בחשכה ככל האפשר כדי למנוע הבהרה פוטנציאלית (photo bleaching).

לאחר שכל זכוכיתי הכיסוי בצלחת אחת קומו), החזיקו את הצלחת בזווית והסירו את הג'לטין העודף מכל באר באמצעות שאיבה בוואקום. לאחר מכן, דגרו את זכוכיתי הכיסוי המצופות בחושך למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת זכוכיתי הכיסוי שלוש פעמים ב-PBS, הוסיפו 500 µL של sodium borohydride.

ההידריד גורם לתסיסה ובועות קטנות ייראו על ומסביב לכל זכוכית כיסוי; הדגירה תתבצע למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי להפחית ולבטל את פעילותו של גלוטראלדהיד שאריתי. הסירו את תמיסת נתרב בורו-הידריד באמצעות שאיבת ואקום בתנועת ניגוב מהירה מסביב לכל באר; היזהרו לא לשאוב זכוכית כיסוי צפה שהסתירה מהדופן התחתונה של צלחת תרבית הרקמה במהלך הטיפול בנתרב בורו-הידריד. לאחר שלושה שטיפות ב-PBS, הדגירו את זכוכיות הכיסוי ב-70% ethanol למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

באמצעות טכניקה סטרילית, העבירו את זכוכית הכיסוי המכילה את הפלטות למכסה זרימה למינרית לתרביות תאי B מסוג שני, ושטפו את זכוכיות הכיסוי שלוש פעמים ב-PBS סטרילי באמצעות מחט ופינצטה סטריליות. העבירו בזהירות את זכוכיות הכיסוי לבאר ריקה של פלטת 24 בארות חדשה, והמתינו עד להשגת שיווי משקל של זכוכיות הכיסוי עם תוצר התרבית עבור סוג התאים הספציפי הנבדק.

כעת זרעו את התאים ישירות על לביבות הזכוכית (cover slips) לאחר זמן אינקובציה מתאים. הכינו את הדגימות לדימוי אימונופלואורסצנציה לצורך סמירת הדגימות. הניחו טיפה של Prolonged Gold Anti-Fade או ריאגנט דומה על סלייד של מיקרוסקופ, מקמו בזהירות את לביבת הזכוכית כשהיא הפוכה, ורכשו תמונות לצורך ניתוח.

ניתוח זה מספק את השטח הנורמלי של פירוק המטריצה ביחס לשטח התאים או למספר התאים. הוא שימושי לניתוח שדות ראייה מיקרוסקופיים שלמים שבהם נוכחים תאים מרובים שעברו טיפול קולקטיבי עם גורמי גדילה של irna או סוכנים טיפוליים. עבור ניתוח זה, נאספו תמונות בהגדלה נמוכה המספיקה לאיסוף יעיל של מידע על אוכלוסיות תאים.

פתחו את התמונה בתוכנת ImageJ. בדקו את מידע קנה המידה ובחרו את המדידות. בחרו באפשרות השטח (Area) ובאפשרות הגבלת הסף (Limit to threshold). חשבו את שטח הפירוק באמצעות תמונת הג'לטין הפלואורסצנטית; תקנו את התאורה הבלתי אחידה לאורך הג'לטין על ידי חיסור סף הרקע, והשתמשו בתמונה כדי לקבוע את ערכי עוצמת הפיקסלים העליונים והתחתונים.

בתמונות הבאות, השתמשו בכפתור ה-set בחלון הסף (threshold) כדי לקבוע את אותו סף עבור כל התמונות, כאמצעי אובייקטיבי לבחירת אזור הפירוק. השתמשו בפונקציית analyze particles כדי למדוד את הסף באזורים של פירוק המטריקס.

בחרו גודל חלקיקים הגדול מאפס כדי להסיר רעשים מהבחירה. הציגו קווי מתאר כדי לזהות אזורי עניין. לאחר מכן, סמנו את האפשרויות "הצג תוצאות" (display results) ו"סיכום" (summarize) כדי להציג מדידות, במידה והשרטוט הגדיר באופן ספציפי את כל אזורי הפירוק.

העתיקו את מדידת השטח הכולל לגיליון אלקטרוני; אם נבחרו אובייקטים נוספים, כגון פסדתיים (debris), רשמו רק את השטחים של אזורי העניין (ROI) הרלוונטיים. לאחר מכן, כדי לחשב את שטח התא, פתחו את תמונת ה-foid והצביעה, ובצעו סף (threshold) לתמונה כדי לקבוע את ערכי עוצמת הפיקסלים העליונים והתחתונים, כך ששולי התאים ייבחרו בתמונות הבאות. השתמשו בכפתור set בחלון הסף כדי לקבוע את אותו סף עבור כל התמונות.

כאמצעי אובייקטיבי לבחירת שטח התאים, השתמש בפונקציית analyze particles כדי למדוד את סף שטח התאים. בחר גודל חלקיק הגדול מאפס כדי להסיר רעשים מהבחירה.

הצג קווי מתאר כדי לזהות אזורים לניתוח, בדוק את תוצאות התצוגה וסכם כדי להציג מדידות שטח. אין לסמן. כלול חורים אם קיימים רווחים בין תאים לבין צבר.

כעת בחרו. העתיקו את תוצאות השטח עבור אזורי העניין הרלוונטיים לגיליון אלקטרוני וחשבו את שטח פירוק הג'לטין ביחס לשטח התאים הכולל. גישה חלופית היא נרמול שטח הפירוק למספר התאים, כפי שנקבע על ידי ספירת גרעינים שצבעו ב-DAPI.

דבר זה חשוב אם המניפולציות משנות את שטח התא הממוצע. עבור גישה זו, השתמש בתוסף nucleus counter כדי לספור גרעינים באופן אוטומטי. התאם את האפשרויות כדי למקסם את התוצאות עבור התמונות שלך. אם גרעינים חופפים באופן נרחב, ספירה אוטומטית עשויה שלא לספק מנייה מדויקת במקרה זה.

ניתן להקל על ספירה ידנית באמצעות תוסף ספירת התאים כאשר התהליך מבוצע כהלכה. למיסכי כיסוי יש ציפוי אחיד של ג'לטין המשורשר ל-Oregon Green 488. מספר ארטיפקטים עלולים להיווצר במהלך הציפוי והעיבוד של מיסכי כיסוי מצופים ג'לטין.

לדוגמה, ציפוי לא אחיד נובע מכיסוי לא תקין של זכוכית המכסה במהלך תהליך הציפוי עקב ערבוב לקוי, פריסה ידנית או התמצקות חלקית של תערובת הג'לטין. שריטות מעידות על הסרה של המטריצה המצופה על ידי חריצה עם מחטים או פינצטות במהלך הטיפול. ייבוש של פני השטח של זכוכית המכסה במהלך תקופות אחסון ממושכות עלול להוביל למראה דמוי ריצוף (cobblestone). אזור זה משקף הבהרה פוטוכימית (photo bleaching) של פני השטח של הג'לטין הפלואורסצנטי במהלך הדמיה עקב חשיפה ממושכת לאור או לאור בעוצמה גבוהה.

שימו לב כי כיסית זכוכית שהוכנה היטב מציגה פלואורסצנציה הומוגנית כאשר היא נבחנת במיקרוסקופ. המטריצות הדקות שנוצרו במהלך הליך זה מספקות אמצעי רגיש להערכת יכולתן של תאים לפרק ECM. לדוגמה.

תמונות אלו לוכדות את פעילות פירוק מטריצת הפודיום הפולשת של תא סרטן ראש וצוואר מסוג OSC 19. כאן תאים נזרעו על לבישת זכוכית מצופה ג'לטין המצומד ל-Oregon Green 488, ודוגמנו באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית המוצגת הן כתמונות דו-ממדיות (2D) והן כתמונות תלת-ממדיות (3D). תאי OSC 19 אלו, שנזרעו על לבישות זכוכית מצופות ג'לטין המצומד ל-Oregon Green 488, סומנו עם Phalloidin מצומד ל-Rhodamine ונוגדני anti-cortactin שנראו באמצעות נוגדן משני ANOR 647, וצבעו באופן פסאודו-כרומטי בירוק עבור החלק הפולש.

הפודיה (Podia) ניכרות בתמונה הממוזגת כריכוזים ציטופלזמיים מוקדיים של F actin ו-cortan, החופפים לאזורים של פינוי ג'לטין. הוויזואליזציה ממחישה כיצד הפודיה הפולשות חודרות אל תוך תת-הנפח של ה-ECMA; נפח זה נוצר כדי להציג קצה בתוך התא שבו נמצאות פודיה פולשות. מבט מהקצה הגבי מדגים פודיה פולשות המוחדרות לתוך הג'לטין שמתחתיהן.

מבט מהקצה הוונטרלי מראה בליטות ב-Veda podia ואזורים של פירוק ג'לטין מתחת לכיסוי הזכוכית (cover slip), כאשר אזורים בצבע אדום מציגים את המטריקס הירוק. תמונות אלו מציגות כמה מהשלבים החשובים לכימות של תאי פירוק מטריקס ג'לטין מנורמלים בתוך תמונה מיקרוסקופית שלמה. כל התמונות הפלואורסצנטיות הומרו לגווני אפור כדי להציג בצורה טובה יותר את סף הצבע האדום (red thresholding) ואת סימוני אזורי העניין (region of interest).

תמונה זו של ג'לטין המשוייך ל-Oregon Green 488 מראה את האזורים הכהים שבהם התרחש פירוק. באמצעות סף (thresholding) של תמונת הג'לטין, מודגשים אזורי הפירוק שמהם נמדדים אזורי עניין נבחרים כדי לקבוע את שטח הפירוק. תמונה זו מראה rumine, foid וצביעה של f actin כפי שצפוי.

סף התמונה של האקטין מדגיש את שטח התא הכולל ממנו נבחרים שטחי התאים למדידה. באופן דומה, ניתן להחיל את הטכניקה על תמונות של גרעיני תאים שנצבעו ב-DAPI. פאנל זה מדגים שלבים נבחרים הכרוכים בכימות של פירוק ג'לטין פלואורסצנטי על ידי תאים בודדים בתוך אוכלוסייה תאית מעורבת.

כימות פשוט זה הוא של תא OSC 19 בודד שעבר טרנספקציה ומבטא באופן יתר קורטין אקטין רקומביננטי המחובר לתג flag. שימו לב כי ניתן לנתח את פירוק המטריצה על ידי תאים שעברו טרנספקציה גם בתוך אוכלוסייה מעורבבת של תאים שעברו טרנספקציה ותאים שלא עברו טרנספקציה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור מספר דברים.

ראשית, ודאו שסמני התאים הפלואורסצנטיים שלכם אינם חופפים לצבע של הג'לטין הפלואורסצנטי. בעת איסוף תמונות, חשוב לבחור שדות על בסיס נוכחותם של תאים. אין לחפש באופן מועדף אזורים של דגרדציה, שכן הדבר עלול להטות את הנתונים בשל השונות בין קווי תאים והתגובות לסוכנים טיפוליים שונים.

יש לבצע אופטימיזציה של גורמים כגון מספר המושבים, זמן הפירוק ובחירת החלבון לסימון אימונופלואורסצנטי עבור הניסוי הספציפי שלך. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לך הבנה טובה לגבי האופן שבו מייצרים לביבות זכוכית (cover slips) מצופות באופן אחיד בג'לטין פלואורסצנטי מתוך בדיקות פירוק המתווכות על ידי beta podia, וכן לגבי שיטות לכימות של פירוק המטריקס.