שחול קבוע לחץ שבשליטת שיטה להכנת בגודל ננו שלפוחית ​​שומנים

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להציג שיטה חסונה להכנה של וזיקולות ליפידיות בעלות רלוונטיות ביולוגית. דבר זה מושג על ידי ערבוב והעברה של פוספוליפידים לבקבוקוני זכוכית והידרציה שלהם באמצעות בופר מימי ליצירת תרחיף SLE רב-שכבתי (multi lamella). כשלב שני, מבוצעת שיטת הקפאה והפשרה, אשר מובילה לאחר מכן לייצור של וזיקולות Ella מווזיקולות רב-שכבתיות.

בשלב הבא, העשיה של הליפוזומים מועברת דרך אקסטרודר (extruder) בלחץ האופטימלי שנקבע, כדי להפיק שלפוחיות ליפידיות הומוגניות בגודל הרצוי. התוצאות שהתקבלו מראות גדלי שלפוחיות תת-מיקרוניים עקביים, בהתבסס על פיזור אור דינמי (dynamic light scattering) ואנליזה של מעקב אחר ננו-חלקיקים (nanoparticle tracking analysis). היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון סוניקציה ושקיעה, הוא ששיטה זו משתמשת במערכת בקרת לחץ עם קצבי זרימה אופטימליים שנקבעו של חנקן להכנה יעילה של גדלי שלפוחיות ליפידיות.

כדי להתחיל בהליך זה, השגו בקבקיות זכוכית של 20 milliliters עם פקק מצופה Teflon; נקו את כל כלי הזכוכית והמזרקים בעזרת chloroform לפני השימוש כדי למנוע זיהום. העבירו 100 microliters של chloroform בדרגת רקיס (reagent grade) לבקבקיות הזכוכית באמצעות מזרק זכוכית אטומ של 250 microliters. הוסיפו 30 microliters של methanol בדרגת רקיס לאותה בקבקיות זכוכית באמצעות מזרק זכוכית אטומ של 100 microliters.

הכינו תמיסת ליפידים של POPC, POPE וכולסטרול בריכוז 2 מילימולרי על ידי העברה של 216 µL של POPC בריכוז 10 mg/mL, 42 µL של POPE בריכוז 10 mg/mL ו-20 µL של תמיסת כולסטרול בריכוז 11 mg/mL למבחנה מזכוכית בנפח 20 mL. האדפו את הממיסים האורגניים באמצעות זרימה איטית של גז ארגון או חנקן עד להשגת שכבה דקה של ליפידים בתחתית המבחנה, והניחו את המבחנה הפתוחה במייבש ואקום למשך 30 דקות לפחות.

כדי להסיר שאריות ממס, העבירו שני מיליליטר של באפר שעבר בעבר סינון דרך פילטר של 0.2 micron למבחנה הזכוכית כדי להידרט את הליפידים. דגרו את התערובת בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך לילה, והשתמשו בה תוך 48 שעות עבור גדלי ליפוזומים של 30 עד 100 nanometers. הקפיאו את ת сусפנזיית הליפוזומים בחנקן נוזלי למשך 15 שניות.

לאחר מכן, הפשיעו את תרחיף הליפוזומים באמצעות בלוק חימום בטמפרטורה של 42 °C למשך כשלוש דקות. חזרו על תהליך ההקפאה וההפשרה למשך חמישה מחזורים בסך הכל. הקפאה ובעקבותיה הפשרה יוצרות unilamellar vesicles מ-multilamellar vesicles ומשפרות את יעילות לכידת השומנים במהלך האקסטרוזיה.

בשלב הבא, הכינו את המערכת לסחיטה על ידי ביצוע ההוראות של Avastin להרכבה מדויקת של ה-lipo so fast. הרכבה נכונה של ה-LF 50 extruder היא קריטית למניעת דליפת חנקן, המשפיעה על קצבי הזרימה הרצויים. כדי להבטיח הצלחה, בצעו את השלבים הבאים בזהירות.

ליצירת איטום אטום לאוויר. הניחו את מסך התמיכה בעל החור הגדול בבסיס מסנן התמיכה, ולאחריו את הכלי המרכזי העגול, דיסק ניקוז אחד וממברנת פוליקרבונט אחת. הניחו את טבעת ה-O-ring השחורה הקטנה מעל לממברנה והדקו אותה לבסיס מסנן התמיכה.

חברו את מיזם המסננת העליון על ידי הידוק ארבעה ברגים בארבעת החורים התואמים. הרכיבו את יחידת מיזם המסננת מתחת לגוף המיזם הגדול. הוסיפו את תמיסת הליפוזומים לגוף הצילינדר שמעל לגוף המיזם.

מקם O-ring מעגלי גדול, מכסה צר, O-ring מעגלי גדול ומכסה מעגלי. חבר את ווסת הגז לחלק העליון של גליל האקסטרודר וסגור את כל השסתומים כדי למנוע דליפת אוויר, כולל את שסתום שחרור הלחץ. מקם מבחנה מזכוכית בנפח 20 milliliter או בקראן ארלנמייר בנפח 50 milliliter מתחת ליחידת המסנן של האקסטרודר.

שסתום ביטחון מחובר לווסת וישחרר לחץ אם הוא יעלה על 600 PSI. אני מדליקה את גז החנקן ופותחת את שסתום הגז המחובר לאקסטרודר. העלי את לחץ החנקן ל-25 PSI עבור ליפוזומים של 400 ננומטר, ל-125 PSI עבור ליפוזומים של 100 ננומטר, ול-400 עד 500 PSI עבור ליפוזומים של 30 ננומטר. עקבי אחר תרחיף הליפוזומים עד שיידחף על ידי החנקן וישפריז למכולה.

המשיכו בזרם החנקן עד שלא ייראה נוזל. העבירו את התמיסה דרך מסנן האקסטרודר אל תוך המבחנה מזכוכית לביצוע אנליזת DLS. ראשית, הכינו 50 µL של תמיסת ליפוזומים בריכוז 20 µM המדוללת במי פוספט {PBS}.

לאחר מכן, הדליקו את מקור המתח ואת מקור התאורה. פתחו את תוכנת ה-dynapro. הגדירו בתוכנה את מודל האלגוריתם לזיהוי ליפוזומים בגודל הרצוי.

לאחר החיבור לחומרה, שאיבה של 14 µL מדגם הליפוזומים לתוך מבחירת הקוורץ והכנסתה למחזיק התא, לחצו על start; לאחר כ-20 עד 30 רכישות (acquisitions), לחצו על stop. נתחו את שיאי קוטר הליפוזומים הממוצעים שנרשמו בהיסטוגרמה. ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (Nanoparticle tracking analysis) מתחיל בהכנת 500 µL של תמיסת ליפוזומים בריכוז 0.1 µM המומסים ב-PBS, שטיפת תא הדגימה במים ובאתנול.

לאחר מכן, ייבשו את תא הדגימה בעזרת נייר סופג נטול סיבים. הפעילו את מקור המתח של הלייזר ואת המחשב, והעבירו 300 µL של תמיסת ליפוזומים בריכוז 0.1 M לתא הדגימה. פתחו את בקר הטמפרטורה ואת התוכנה לניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (nanoparticle tracking analysis).

לחצו על כפתור הלכידה כדי להפעיל את הלייזר. השתמשו בכיוונונים האופקיים והאנכיים כדי להזיז את הבמה ולהתאים את מיקוד המיקרוסקופ. הגדירו את הטמפרטורה הרצויה ואת זמן ההקלטה.

לחצו על כפתור ההקלטה כדי לצלם מספר פריימים של חלקיקי הליפוזום למשך זמן מוגדר. נתחו את הפסגות המתאימות לקוטר גודלי הליפוזומים בהיסטוגרמה, בעוד היא עוקבת אחר תנועתו של כל חלקיק. DLS היא שיטה מבוססת האוספת אור מפוזר כדי לקבוע את קוטר החלקיק, והיא בוצעה כדי לקבוע את גודלי הליפוזומים.

ליפוזומים מהודרים הועברו בתהליך אקסטרוזיה דרך ממברנות פוליקרבונט בגדלים ובלחצים שונים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. קוטרי הליפוזומים שנמדדו באמצעות DLS עבור גודל נקבים של 30 nanometer היו 66 פלוס או מינוס 28 nanometers. עבור גודל נקבים של 100 nanometer הקוטר היה 138 פלוס או מינוס 80 nanometers, ועבור גודל נקבים של 400 nanometer הקוטר היה 360 פלוס או מינוס 25 nanometers.

תמיחת חלקיקי פוליסטירן מלוטשים בקוטר 50 ננומטר שימשה כסטנדרט כיול, כאשר נמדד קוטר של 47 פלוס או מינוס 16 ננומטר. אחוז הפולידיספרסיות (polydispersity) מעיד כי אין חפיפה בין גדלי הליפוזומים. מקובל לראות קוטרים הגבוהים מ-30 ננומטר בעת שימוש בניתוח DLS, וזאת בשל ההטיה הידועה של מכשיר זה כלפי חלקיקים גדולים יותר.

למרות מגבלה מכשירית זו, עקומת הכיול מתארת מתאם ליניארי. ניתוח מעקב אחר ננוחלקיקים (NTA) היא טכנולוגיה חדשה המודדת את גודלן של כל החלקיקים באמצעות תצפיות ישירות על דיפוזיה בתוך מדיום נוזלי, ללא תלות במקדם השבירה או בצפיפות של החלקיקים. ניתן להשתמש בטכניקה זו בעלת הרזולוציה הגבוהה כהשלמה למדידת ליפוזומים באמצעות DLS; ב-NTA נרשמו קטרי של 95 ± 48 nanometers ו-356 ± 51 nanometers עבור שני תסמיני פוליסטירן של 100 nanometers ו-400 nanometers ששימשו לכיול.

לתמיסות ליפידים יש קוטר הדומה יותר לתוצאות ה-DLS, אשר הניבו גדלים ממוצעים של 29 ± 14 nanometers עבור גודל נקבים של 30 nanometers, 95 ± 17 nanometers עבור גודל נקבים של 100 nanometers ו-359 ± 73 nanometers עבור גודל נקבים של 400 nanometers. NTA עשויה להיות טכניקת אפיון כללית יותר לכימות חלקיקים מיקרוסקופיים, שכן הרגישות שלה מאפשרת מדידה של חלקיקים בגודל 50 עד 1000 nanometers. עקומת הכיול מראה מתאם ליניארי בין נקבי ממбраנת הפוליקרבונט לבין הקוטר שנמדד ב-NTA. תמונות מיקרוסקופיה אלקטרונית בשידור עם צביעה שלילית מראות כי כל גודל ליפוזום לאחר אקסטרוזיה בגדלים של 3, 100 ו-400 nanometers הוא מובחן בבירור מהשאר.

ההגדלה נקבעה ל-25,000 פעמים, כאשר סרגל המقياس מייצג 0.5 microns. ניסוי של סדרת זמנים בוצע עם שלושה גדלי ליפוזומים. מדידת DLS בוצעה עבור כל תמיסת ליפוזומים מיד לאחר האקסטרוזיה.

כל תמיסאות הליפוזומים נשמרו בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך לילה. קטריהן נמדדו שוב באמצעות DLS לאחר דגירה למשך לילה. לא נצפה שינוי, או שנצפה שינוי מזערי, לאחר תקופת דגירה של 60 שעות. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי מעברים מרובים דרך מסנן האקסטרוזיה ישפרו את הומוגניות תמיסת ה-Vesco.

כמו כן, זכרו להשתמש במבחנות זכוכית ובמזרקים להכנת הדגימות כדי למנוע זיהום כתוצאה מהשכמה של פוליפרופילן ממשפחונות על ידי כלורופורם.