השומנים bilayer שלפוחיות דור שימוש Microfluidic jetting
21 בפברואר 2014
jetting microfluidic נגד bilayer שומנים ממשק אגל מספק דרך אמינה כדי ליצור שלפוחית עם שליטה על חוסר סימטריה בממברנה, שילוב של חלבונים הטרנסממברני, ואנקפסולציה של חומר. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד מגוון רחב של מערכות ביולוגיות שבי ביומולקולות הממודרת הן רצויה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור שלפוחיות דו-שכבתיות פוספוליפידיות עם שליטה מוגברת על הממברנה, ה-unla, המולריות, פיזור המונו והתכולה הפנימית. באמצעות cad מיוצר תא מיריעות אקריליות וגומי טבעי. שכבת שומנים תלויה מיוצרת על ידי העמסת החדר בשומנים ותמיסה.
לאחר מכן, הזרקת דיו המכילה את התמיסה שיש לעטוף מוגדרת עם מנגנון ההזרקה. לאחר קביעת ההגדרות המתאימות, פולסים של נוזל סילוני ייצרו שלפוחיות דו-שכבתיות של שומנים. בסופו של דבר, סילון מיקרופלואידית מניב שלפוחיות דו-שכבתיות מפוזרות חד-שכבתיות הניתנות לחזרה.
היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו היווצרות אלקטרו, תחליב או יצירת טיפות, הוא רמת בקרה מוגברת של ממברנה, מולריות חד צדדית, פיזור מונו ותכולה פנימית. תדגים את ההליך ג'והנה הארו, סטודנטית לתואר שני ממעבדה ותסייע קארה פאטל, סטודנטית לתואר ראשון המשתמשת בתוכנת CAD, לצייר צורה לתא שניתן לייצר מאקריליק באמצעות מקדחה ראשונה של חותך לייזר, אחד בגודל 16 אינץ' דרך חורים משני צידי החדר האקרילי המורכב. זה יתנקז לבאר בצורת אינסוף.
שנית, חותכים מלבן קטן עם מספריים מגיליון אקרילי של 0.2 מילימטר כדי לשמש כתחתית בצורת האינסוף. אבטח אותו היטב עם דבק המתייבש במהירות, והקפד לא לקבל דבק באזורי הצפייה. יש לשטוף את יריעת האקריליק לקיר החדר ולהדק אותה לתחתית החדר.
שלישית, השתמש בדבק המתייבש במהירות כדי להדביק חתיכה דקה של יריעת גומי טבעית מעל החורים הקדוחים. לחץ אותם במקומם בעזרת פינצטה. בדוק את כל התפרים המודבקים לאיתור נזילות.
לא צריך להיות כזה. לבסוף, באמצעות מחט בגודל 23, תקעו חורים בגומי דרך החורים הקדוחים, קצה הזרקת הדיו הפיזואלקטרי יוכנס דרך החורים הללו. יש להמיס פוספוליפידים במלאי בכלורופורם ולאחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס.
D-P-H-P-C או DOPC. ליפידים משמשים בהדגמה זו. שומנים מומסים בכלורופורם מועברים לבקבוקון זכוכית תוך החזקת הבקבוקון בזווית, מייבשים בעדינות את השומנים מתחת לארגון או גז חנקן.
לאחר מכן הנח את הבקבוקון כשהמכסה שלו מעט רופף תחת ואקום למשך שעה עד שעתיים כדי להסיר שאריות ממס. ניתן להשתמש גם בחומר ייבוש לשלב זה. כעת ממיסים את השומנים בסיפון הקצה לריכוז שומנים סופי של 25 מיליגרם למיליליטר.
מערבולת הפתרון. אטמו בקצרה את הכובע עם פרם ואז סוניקציה למשך 15 דקות. אחסן תמיסה זו בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, הכינו תמיסת סוכרוז מלאי עם אוסמולריות פיזיולוגית. זהו פתרון הסילון. שקול להוסיף טיפה של צבע מאכל כהה או חרוזים פלואורסצנטיים לתמיסה לתוספת ניגודיות או פלואורסצנטיות.
טען את תמיסת הסוכרוז למזרק מיליליטר אחד כדי להסיר אוויר כלוא. הקישו את המזרק כך שכל הבועות יעלו לפתח הפיתוי וניתן יהיה להוציא אותן. לאחר מכן, חבר פילטר 33 מילימטר 0.22 מיקרון למזרק ודחף טיפה אחת החוצה דרך המסנן.
כעת הברג את מתאם הפיתוי הנשי של הזרקת הדיו ולחץ אותו על קצה המסנן. דחוף החוצה מעט נוזל כדי להסיר אוויר כלוא. לבסוף, חבר את המזרק לחלק העליון של נוזל הזרקת הדיו.
צריך לעבור לקצה הזרקת הדיו אם המזרק חובר כהלכה. ראשית, הרכיבו את מכלול המזרק לשלב המיקרוסקופ וחברו את בקר הזרקת הדיו לניסוי זה. הבמה והמזרק זקוקים לשליטה עצמאית כאשר הבמה והמזרק נעים שניהם בתלת מימד לצורך הדמיה.
הגדר מצלמה במהירות גבוהה המסוגלת ל-1000 פריימים לשנייה לפחות. הגדר אותו לשימוש בהפעלה אוטומטית מבוססת תמונה כדי ליזום הקלטות. כעת, אבטח את החדר לבמה בעזרת סרט ויישר בזהירות את קצה הזרקת הדיו עם החור שנעשה ביריעת הגומי בצד החדר.
ראשית, התאם לפי העין ולאחר מכן בצע התאמות עדינות באמצעות המיקרוסקופ. לאחר היישור, החזר את המזרק לאורך מימד אחד כדי לטעון את צורת האינסוף. ובכן, הפעל לחץ עדין על הבוכנה, כך שנוצרת טיפה על הזרבובית.
זה מספק קצת לחץ גב ראשוני. יש להגדיר את פרמטרי הסילון. הערכים הספציפיים הבאים עבור גל דו קוטבי טרפזי מוצגים על המסך מתח מופעל ומספר פעימות הסילון לכל גודל שלפוחית בקרת ההדק.
כעת טען את החדר ב-25 עד 30 מיקרוליטר של תמיסת השומנים בסוף העשור, המכסה את כל פני השטח של צורת האינסוף. ובכן אז לכל אחד, ובכן הוסף 25 מיקרוליטר תמיסת גלוקוז לקצה החיצוני ביותר פיפטינג לאט וחלק, הגלוקוז לא אמור להתערבב בתמיסת השומנים. תוך 10 דקות תיווצר שכבת שומנים דו-שכבתית במרכז החדר.
הגדרת השכבה הדו-שכבתית היא השלב הקריטי ביותר מכיוון שהשכבה הדו-שכבתית אינה יציבה ועלולה להישבר בהתאם להכנה. היו סבלניים. זה יסתדר ברגע שתתרגל למלא את החדר כמה פעמים.
כעת, הכנס בזהירות את קצה הזרקת הדיו בחזרה לתא כאשר הקצה נמצא בטווח של 200 מיקרון מממשק הטיפות. דו-שכבתי, התחל את תהליך הסילון והקלט את הנתונים באמצעות הזרקת הדיו סיפק תובנה לגבי תהליך יצירת השלפוחית. לדוגמה, שינוי המרחק בין פיית הזרקת הדיו לשכבת השומנים הדו-שכבתית השפיע על הכוח המעוות את הממברנה. קרוב.
הקרבה לשכבה הדו-שכבתית מיקדה את זרם הסילון ומנעה מהממברנה לפזר אנרגיה הרחק מנקודת יצירת השלפוחית. כמו כן, תנועת המערבולת גדלה עם המתח המופעל על המפעיל החשמלי של הפיזו. היווצרות השלפוחית הודגמה כרצף של אירועים לאחר היווצרותם.
יציבות השלפוחית נטתה להשתנות עם קוטר השלפוחית, כאשר שלפוחיות קטנות יותר היו יציבות יותר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור שלפוחיות מפרות שומנים באמצעות סילון מיקרופלואידי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה דן בשיטה ליצירת וזיקולות של דו-שכבת פוספוליפידים באמצעות התזה מיקרופלואידית אל מול דו-שכבת ליפידים בממשק טיפה. טכניקה זו מאפשרת שליטה מדויקת באסימטריה של הממברנה, בהטמעת חלבונים טרנס-ממברנליים ובכליסה של חומרים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביופיזיקה
- ביוטכנולוגיה
רקע
- שלפוHשפוספיד ביליאריי (Phospholipid bilayer vesicles) חיוניות לחקר של ביו-מולקולות המופרדות במדורים.
- טכניקות מיקרופלואידיות משפרות את השחזוריות והשליטה ביצירת וסיקולות.
- הבנת תכונות הממברנה היא קריטית ליישומים ביולוגיים שונים.
- טכנולוגיית התזה (Jetting technology) יכולה לייעל את תהליך יצירת הוסיקולות.
מטרת המחקר
- ליצירת וזיקולות עם מאפייני ממברנה מבוקרים.
- להקל על שילובם של חלבונים ספציפיים בתוך השכבה הכפולה.
- לאפשר כליסה של חומרים שונים למטרות מחקר.
שיטות מעבדה שנעשה בהן שימוש
- ייצור תא מלוחות אקרילי וגומי טבעי.
- הפקת שכבה שומנית כפולה תלויה (suspended lipid bilayer) על ידי מילוי התא בליפידים ובתמיסה.
- הקמה של מכשיר הזרקת דיו (inkjet) לאנקפסולציה של תמיסות.
- קביעת הגדרות מתאימות לפולסי נוזל מותז ליצירת וזיקולות.
תוצאות עיקריות
- הזרקה מיקרופלואידית מייצרת וזיקולות דו-שכבתיות בעלות התפלגות אחידה וניתנות לשחזור.
- השיטה מאפשרת בקרה מדויקת על תכונות הוזיקולות.
- כימוס של חומרים מושג באופן יעיל.
- ניתן להתאים את הוזיקולות למגוון מחקרים ביולוגיים.
מסקנות
- הזרקה מיקרופלואידית היא טכניקה אמינה ליצירת וסיקולות.
- השליטה על אסימטריה של ממברנה ושילוב חלבונים משופרת.
- לשיטה זו השלכות משמעותיות על חקר של ביו-מולקולות מופרדות למדורים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הזרקה מיקרופלואידית מאפשרת שליטה מדויקת ביצירת שלפוחיות של שכבה ליפידית כפולה, ובכך תומכת בייצור הדיר השחזר של שלפוחיות ענקיות חד-שכבתיות (GUVs) בעלות הרכב ממברנה ויכולת כלילה מוגדרים. יכולת זו נותנת מענה לאתגר מרכזי במחקרים של ביולוגיה סינתטית והולכת תרופות על ידי אספקת פלטפורמה ניתנת לכוונון למידול מערכות תאיות ובדיקת תרכובות ביו-אקטיביות. השיטה משפרת את מידת הביטחון החזיונית בשלבים מוקדמים של תיקוף מטרות, בכך שהיא מאפשרת בחינה שיטתית של תהליכים התלויים בממברנה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות בקרה על אסימטריה של ממברנה והטמעה של חלבונים טרנס-ממברנליים.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי יצירת מערכות וזיקולות הניתנות לשחזור לצורך הבהרת מסלולים.
- ערך ניבוי: מסייע במיון תיקי פיתוח באמצעות אספקת מדדים כמותיים על אינטראקציות בין ליפידים לחלבונים ועל יעילות הכליאה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות מתוקשפות עבור תהליכי עבודה המשכיים על ידי ייצור של וזיקולות מונו-דיספרסיביות עם גודל ותוכן פנימי ניתנים לכיוון.
- ערך תפעולי: נותן מענה לסטנדרטיזציה ושחזוריות של בדיקות באמצעות פרמטרי התזת סילון מדויקים השולטים ביצירת הוזיקולות.
- מוכנות לסריקה: מדגיש את יכולת ההרחבה והשימוש החוזר של הפלטפורמה להערכה אמינה של תרכובות תחת תנאים מרובים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רציפות תרגומית: דן ברלוונטיות למחלה באמצעות שימוש בתמיסות אוסמולריות דמויות פיזיולוגיות ומעקב פלואורסצנטי לניטור וזיקולות.
- הלימה פרה-קלינית: מתאר רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני, על ידי מתן אפשרות לכלילה של מועמדים טיפוליים לצורך מחקרי יציבות ושחרור.
- קידום מותאם סיכון: תומך בקבלת החלטות באמצעות אספקת תוצאות מדידות על יציבות וזיקולות וביצועים התלויים בקוטר.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ראשונית ועד לזיהוי מובילים (leads), ובמיוחד במבחנים הדורשים סביבות ממברנה מבוקרות והולכה של תרכובות encapsulated.
- ביולוגיה של הגילוי: מסביר כיצד השיטה תומכת בבדיקת השערות על ידי כך שהיא מאפשרת שינוי שיטתי של הרכב הליפידים וההטמעה של חלבונים טרנס-ממברנליים כדי להבהיר תלויות במסלולים.
- סריקה: מתאר את המוכנות של הבדיקה באמצעות יצירת וסיקולות מונו-דיספרסיביות המבטיחות חשיפה עקבית של תרכובות ותוצאות הניתנות לשחזור.
- אנליטיקה: מדגיש מדידות כמותיות כגון גודל הוסיקולות, קצב היווצרות ויעילות אנקפסולציה, המסייעות לצוותים להשוות בין תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מקשר את השיטה לרצף פרה-קליני על ידי כך שהיא מאפשרת אנקפסולציה של תרופות או ביו-מולקולות לצורך בדיקות יציבות ואפיון שחרור.
- שימוש חוזר ארגוני: מציג את השיטה כבסיס ליכולת הניתנת לשימוש חוזר ולא כטכניקה של פעם אחת, הניתנת להתאמה למספר פרויקטים הדורשים פלטפורמות של וסיקולות סינתטיות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזואי, תיקוף מטרה, והפחתת עמימות מכניסטית במנגנונים הקשורים לממברנה.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה (scalability) של ייצור וסיקולות ליישומים בעלות תפוקה גבוהה.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך הפיתוח (go/no-go), יעילות הון והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים באמצעות הפחתת סיכונים מוקדמת של מנגנוני הובלה.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף וקבלת החלטות על קידום הפיתוח המותאמות לסיכון, על בסיס נתוני ביצועים של וסיקולות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרופלואידיקה, טיפול בליפידים ובמיקרוסקופיה לצורך הרכבת התא ויצירת השכבה הכפולה.
- תלוי במכשור הכולל מכשירי הזרקה עם הנעה פייזואלקטרית, מצלמות במהירות גבוהה ומערכות ייבוש בוואקום.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של תמיסות ליפידים, פרמטרי הזרקה ונהלי יישור של התא.
- כולל שיקולי התאמה לסוגי ליפידים שונים, חלבונים טרנס-ממברנליים וחומרי אנקפסולציה במערכות מודל שונות.
- כולל מגבלות מעשיות כגון חוסר יציבות של השכבה הכפולה במהלך ההקמה ורגישות לרעידות סביבתיות בזמן ההזרקה.
