תלת מימדי תרבית תאים מודל למדידת השפעת זרימת הנוזל ביניים על הפלישה תאים סרטניים

מטרת פרוצדורה זו היא לחשוף תאים שגודלו בתלת-ממד (3D) לזרימה של נוזל בינתיים, ולכמת את ההשפעות המתווכות על ידי הזרימה על פלישת תאים. הדבר משיג תחילה על ידי הכנת תמיסת ג'ל המורכבת מקולגן מסוג 1 ומ-matrigel. השלב השני הוא הוספת ריכוז מוגדר של תאים לתמיסת הג'ל.

בשלב הבא, תרחיף התאים מתווסף למערכת transwell בקוטר 12 מילימטר וגודל נקבים של שמונה מיקרון, ומודגכר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שהמטריקס הופך לג'ל. השלב האחרון בהקמת הבדיקה הוא הוספת כמויות ספציפיות של מצע גידול ל-transwells כדי ליצור תנאים סטטיים ותנאי זרימה. לאחר 24 שעות, ממברנות ה-transwell מקובעות, נצבעות ונערכות לצפייה לצורך כימות מספר התאים שפלשו.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תאי זרימה אינטרסטיציאלית מיקרופלואידיים, הוא שאינה דורשת משאבות או ציוד ייעודי, והיא מאפשרת לחוקרים לבחון מספר תנאים או טיפולים בקלות ובמהירות. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי נדידה ופלישה תאית, ניתן להשתמש בה או ליישמה גם כדי לחקור את השפעת הזרימה של נוזל אינטרסטיציאלי על התנהגויות תאיות רלוונטיות אחרות, כגון ביטוי חלבונים, שגשוג תאים ושינויים באיתות תאי. הדגמת הליך זה תהיה LIMA two chaa.

סטודנט לתואר שני במעבדה שלי יתחיל את הפרוצדורה על ידי הנחת מנה קטנה של matri gel על קרח בטמפרטורה של 4°C. לאחר מכן, יש להכין את תרסיף הג'ל עם PBS, מים סטריליים, נתרשן (sodium hydroxide), matrigel וקולגן מסוג 1 מזנב חולדה. לאחר מכן, ערבבו את רכיבי הג'ל על קרח לפי אותו סדר, והדגרו את התמיסה הסופית למשך שעה אחת בטמפרטורה של 4°C.

כעת הניחו בעזרת פינצטה סטרילית תאי תרבית (inserts) בקוטר 12 מילימטר בתוך פלטה בעלת 12 בארות. לאחר מכן, ספרו את התאים והשביו אותם לנוזל תרבית ללא סרום בריכוז של 5 × 10⁶ תאים ל-milliliter, והוסיפו 100 µL של תרחיף התאים ל-900 µL של תמיסת ג'ל. לאחר מכן, ערבבו אותם היטב על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה.

לאחר מכן, הוסף 150 µL מהתערובת הסופית לכל סבסב (insert). לאחר מכן, העבר את הסבסבים לאנקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide למשך 30 דקות עד לפולימריזציה של הג'ל. עבור התנאי הסטטי, הוסף 100 µL של מצע גידול ללא סרום מעל הג'ל ו-1,200 µL מתחת לסבסב.

מפלסי הנוזלים בתוך ומחוץ למערכת ההכנסה (insert) בבאר צריכים להיות שווים בקירוב, כדי להביא להפרש לחצים מינימלי על פני הג'ל ולמנוע זרימה בינאיית. עבור תנאי הזרימה, הוסיפו 100 µL של מצע ללא סרום מתחת למערכת ההכנסה ו-650 µL מעל הג'ל. במקביל, השתדלו להימנע מיצירת בועות אוויר מתחת למערכת ההכנסה, שכן הן ימנעו מהתאים לנדוד דרך הממברנה בנקודות אלו.

לאחר מכן, הכניסו את הפלטה לאנקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide למשך 24 שעות. בשלב זה, הוסיפו 500 µL של PBS בריכוז 1x לכל באר בפלטה חדשה בעלת 24 בארים לצורך שטיפת האינסרטים. לאחר מכן, הסירו את המצע שנותר בחלק העליון של בארי ה-flow trends.

בשלב הבא, השתמשו במקלוני צמר גפן כדי להסיר את הג'ל מההסבבים (inserts). נגבו את החלק העליון של פני השטח של הממברנה כדי להסיר תאים שאינם VA. לאחר מכן, שטפו את ההסבבים על ידי הנחתם בתוך פלטת 24 באריים המכילה 1x PBS למשך 15 שניות.

לאחר מכן, הסר את ה-PBS והוסף 500 µL של 4% paraformaldehyde מתחת לכל תבנית (insert). דגרו אותם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לקבע את התאים שעברו נדידה (transmigrated cells). לאחר מכן, הסר את ה-PFA ושטוף אותם פעם אחת עם 500 µL של PBS כדי להסיר את שאריות החומר המקבע.

בשלב הבא, הוסיפו 500 µL של תמיסת 0.5% Triton X 100 מתחת למסננים (inserts) והדרימו למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. כדי להחדיר את החומרים לתאים (permeabilization), חתכו את הממברנות מהמסנן באמצעות להב תער. לאחר מכן, העבירו אותן לתוך 100 µL של DPI בריכוז 2 µg/mL בתמיסת 1× PBS.

יש להקפיד להניח את הצד התחתון של הממברנה כלפי מטה. יש להכין את תמיסת ה-DPI מספר דקות לפני השימוש ולשמור אותה בחשכה. כעת עטפו את הפיתח בנייר אלומיניום.

הנח את הדגימה על שייקר במהירות של 150 RPM למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטוף את הממברנות פעם אחת ב-500 microliters של PBS והנח אותן שוב על השייקר למשך 10 דקות. כדי להסיר jy חופשי, חזור על השטיפה פעמיים נוספות.

השלב הבא הוא להניח את הממברנות על slides של זכוכית, כאשר התאים שעברו תהליך של trans migration פונים כלפי מעלה. הוסף תמיסת קיבוע (mounting solution) לממברנות. לאחר מכן, כסה אותן ב-cover slips.

לאחר מכן, ספרו את הגרעינים הצבועים וחשבו את מספר התאים שפלשו בהתאם לכתב היד המצורף. איור זה מציג תאי MDA MB 4 35 s שעברו נדידה חוץ-קרומית על גבי הממברנה. התאים הפולשים קובעו לאחר בדיקת הפלישה בזרימת נוזל בינאי (interstitial fluid flow invasion assay) ונצבעו ב-DPI וב-Alexa Fluor 4 88 conjugated foid כדי להקל על ספירת התאים הפולשים.

זוהי הממברנה תחת מיקרוסקופ שדה בהיר (brightfield), וכאן גרעיני התאים הצבועים ב-DAPI. כאן מוצגים ה-F-actin שצבעו Alexa Fluor 488 phalloidin. גרף זה מראה כי הפלישה של תאי מלנומה מטאסטטית מסוג MDA-MB-435 הוגברה באופן משמעותי על ידי זרימה אינטרסטיציאלית.

לאחר 24 שעות, התוצאות מנורמלות לממוצע של תנאי הפלישה הסטטי, ומוצג הממוצע משש מבחנות תרבית תאים (inserts). ההבדל בין התנאים הוא מובהק סטטיסטית עם ערך P של 0.003. לאחר רכישת המיומנות, ניתן להקים את בדיקת זרימת הנוזל הבין-תאי בשעתיים, לאחר מכן דגירה של 24 שעות, ולאחר מכן שעתיים עבור קיבוע וצביעה של ממברנות הטרנספורם.

בעקבות הליך זה, ניתן להפיק בקלות תאים, חלבונים או חומצות גרעיניות כדי לענות על שאלות נוספות, כגון כיצד משתנים ביטויי גנים וחלבונים בתגובה לזרימה של נוזל בינאיסטי (interstitial fluid flow). מאז פיתוחו, הפך מבחן זה לחיוני עבור חוקרים הבוחנים את השפעות הזרימה הבינאיסטית על תאי סרטן.