פרוטוקול פשוט לחילוץ Hemocytes מזחלי Wild
15 בנובמבר 2012
hemocytes חרקים למלא תפקידים חשובים רבים, הוא חיסון ושאינם מחוסנים, לאורך כל שלבי התפתחות חרקים. הידע הנוכחי שלנו של הסוגים והתפקוד hemocyte מגיע ממחקרים על מודלים גנטיים של חרקים. כאן, אנו מציגים שיטה לחילוץ, כימות והמחשת hemocytes מזחלים פרא.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להפיק, לדמיין ולספור המוציטים (hemocytes) מזחלי פרפרים פראיים. הדבר מושג תחילה על ידי הרדמת הזחל באמצעות הנחתו על קרח, הזרקת תמיסת בופר המכילה נוגד קרישה, והחזרת הזחל אל הקרח כדי לאפשר להמוציטים לחזור למחזור הדם לפני ההפקה. השלב השני הוא ביצוע חתך רדוד בקצה האחורי של הזחל באמצעות סקאלפל נקי.
בשלב הבא, לוחצים בעדינות על הזחל באמצעות פינצטה רכה. לאחר מכן, שואבים את תערובת תמיסת הבאפר וההמולימפה באמצעות מיקרו-פיפט ומעבירים אותה למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה. השלב האחרון הוא ערבוב עדין של תמיסת ההמולימפה עם נפח שווה של תמיסת באפר, והעברה של 10 µL מהתמיסה להמוציטומטר לצורך ויזואליזציה וספירה של מספר ההמוציטים.
בסופו של דבר, ניתן להשתמש בשיטה זו להוצאת המוציטים כשיטה מהירה ויעילה לספירתB המוציטים ממיני זחלי שַׁפְשּׁוּף שונים, וככלי לבחינת היבטים פיזיולוגיים של התגובה החיסונית התאית של החרקים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה כדי להוציא המולימפה מזחלים עם רגליים מצומצמות מאוד. דגמי זחלים אחרים מוממים על ידי חיתוך של אחת הרגליים, תוך הוצאת המוציטים מהנוזל שיוצא.
בנוסף, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי להוציא המולימפה ממיני חרקים אחרים. שיטה זו יכולה לשמש למענה על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה האקולוגית, כגון כיצד התגובה החיסונית התאית של החרק משתנה בהתאם לאיכות התזונה, לשלב ההתפתחות או לחשיפה לפתוגנים שונים. כדי להתחיל בהליך זה, הרדימו את הזחלים בשלב השלת לפני האחרון על ידי קירורם על קרח למשך 20 דקות לפני הוצאת התאי ההמולימיים.
לאחר מכן, הכניסו את הקצה התמים של מחט קפילרית נקייה בקוטר 16 gauge לתוך הפחית המחוברת למזרק זכוכית של 20 מיליליטר. השאירו את הפחית המכילה את תמיסתו האיסוף פתוחה על שולחן המעבדה. מלאו באיטיות את הקפילרה בכ-10 עד 15 µL של בופר.
לאחר מכן, הניחו את המחט על כדור חימר הממוקם לצד מיקרוסקופ הדיססקציה. הניחו את הזחל בצלחת פטרי. יש למקם את החרק על צדו כך שהספרואידים יהיו גלויים בבירור.
בזמן הצפייה תחת מיקרוסקופ סטריאו, החזיקו את הזחל במקומו באמצעות פינצטה והניחו את המחט קרוב לאחד מהפלחים הכדוריים, שם קוטיקולה של החרק רכה בדרך כלל. לאחר מכן, לחצו בעדינות את מחט הנימילית כנגד גופו של החרק. ברגע שהמחט חדרה דרך הקוטיקולה, מזריקו את מלוא נפח התמיסה אל תוך הזחל.
גוף הזחל יתנפח בעקבות ההזרקה, אך הוא לא אמור להתבקע או לה mengeluarkan נוזלים. החזיר את הזחל לצ그러ת המקורה בקרח. מקם את החרק על גבו כדי למנוע דליפה של הבאפר מהפצע.
חזור על ההזרקות עבור כל זחל ששימש לחילוץ הלימפה ההמוlynetic. לאחר מכן, השאר את כל החרקים להתקרר על קרח למשך 30 דקות. כעת, הנח את הזחל בתוך צלחת פטרי תחת מיקרוסקופ הדיסקציה.
בצעו בזהירות חתך רדוד באורך של כשני עד שלושה מילימטרים באזור האחורי של הזחל, באמצעות סכין מנתחים (scalpel) סטרילית, מבלי לפגוע במעי או באיברים פנימיים אחרים. לאחר מכן, לחצו בעדינות על הזחל באמצעות פינצטה פלסטית גמישה, תוך איסוף של כ-10 עד 20 µL של תערובת ההמולימף באמצעות טיפ של פיפטה בנפח 10 µL. שוב, היזהרו לא לפגוע ברקמות הפנימיות.
לאחר מכן, השליכו את שאריות הזחלים. אספו את ה-hemo limp מכל זחל למבחנות מיקרו-צנטריפוגה נפרדות, מסומנות ומסליקוניות, בנפח של 0.5 milliliter. לאחר מכן, הוסיפו בערך 10 עד 20 microliters של תמיסת הדגירה לכל דגימת hemo limp שנאספה מזחל בודד.
שמור את דגימות ההמולימפה על קרח בכל עת בשלב זה. ערבב את דגימת ההמולימפה ואת תמיסת האינקובציה מיד לפני ספירת ה-hemocytes.
טיפול זה מאפשר הפרדה תקינה של ההמוציטים ומונע התגבשות. השתמשו בקצה פפית נקי כדי להעביר 10 µL של דגימת המולימפה מעורבבת עם תמיסת האינקובציה אל המוציטומטר. לאחר מכן, באמצעות מיקרוסקופ פועל (compound microscope), ספרו ורשמו את מספר ההמוציטים בלפחות 15 מהריבועים הגדולים של הסריג המרכזי של ההמוציטומטר.
חברו ערכים אלו כדי לקבל סכום כולל של מספר ההמוציטים ב-15 הריבועים. לאחר מכן, שטפו ביסודיות את ההמוציטומטר ואת זכוכית הכיסוי שלו באמצעות בקבוק שטיפה עם מים מזוקקים ודה-יוניים. לאחר מכן, נגבו אותם עד לייבוש בעזרת נייר סופג מסוג Kim wipes.
חזרו על הפרוצדורות עבור שאר דגימות ה-hemo limp וחשבו את מספר ה-he cytes הממוצע למיליליטר של נפח hemo limp עבור כל זחל. תמונת מיקרוסקופיית השדה המואר (brightfield microscopy) מציגה he cytes שחולצו מזחלי nucle hin ai בהגדלה של 20 x. בעקבות פרוצדורה זו, ניתן להשתמש ב-he cytes שנאספו כדי לחקור את התגובה החיסונית התאית ולהקים בדיקות כגון פגוציטוזה (phagocytosis), cap, encapsulation ופעילות pH oxidase.
בנוסף, ניתן לאסוף R-N-A-D-N-A וחלבונים שלא נוצלו עבור בדיקות נוספות, במטרה לחקור תגובות חיסוניות תאיות אלו בחרקים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן ההזרקה לזרזיים לצורך הפקת המולימפה, וכיצד לאסוף המולימפה המכילה המוציטים חיים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה למיצוי, כימות והדמיה של המוציטים מדודקים בטבע. להמוציטים תפקידים מכריעים הן בתפקודים חיסוניים והן בתפקודים שאינם חיסוניים לאורך התפתחות החרק.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אימונולוגיה של חרקים
- תפקוד המוציטים
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- המוציטים חיוניים לתגובות החיסון של חרקים.
- הבנת סוגי ההמוציטים מסייעת בחקר הביולוגיה של חרקים.
- הידע הנוכחי מבוסס בעיקר על מודלים גנטיים.
- מחקר זה מתמקד בזחלי פרפרים ברים במטרה להרחיב את הידע הקיים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה להפקת המוציטים.
- ויזואליזציה של המוציטים להבנה טובה יותר של תפקודיהם.
- כימות של המוציטים להערכת תפקידם בפיזיולוגיה של חרקים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הרדמת זחלים על קרח.
- הזרקת תמיסת בופר עם נוגד קרישה.
- ביצוע חתך רדוד להקל על מיצוי ההמוציטים.
- שאיבת ההמולימפה וערבובה עם בופר לצורך ניתוח.
תוצאות עיקריות
- הצלחה במיצוי ובויזואליזציה של המוציטים.
- כימות של המוציטים באמצעות המוציטומטר.
- הוכחת היתכנות של השיטה בזחלים ברים.
- מתן תובנות לגבי זרימה ותפקוד של המוציטים.
מסקנות
- השיטה מאפשרת מחקר יעיל של המוציטים בזחלי פרפרים בטבע.
- משפרת את ההבנה של תגובות חיסוניות בחרקים.
- ניתנת ליישום במיני חרקים אחרים לצורך מחקרים השוואתיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיצוי וכימות מהימנים של המוציטים (hemocytes) מזחלי פרא מאפשרים את חקר מנגנוני החסינות המולדת במיני חרקים שאינם מיני מודל, ובכך תומכים בתיקוף יעדים בשלבים מוקדמים של אימונולוגיית חרקים. פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה סטנדרטית לבידוד תאי מערכת החיסון, ובכך מקל על ביצוע מחקרים השוואתיים ובדיקות תפקודיות הרלוואנטיות למחקר תרגומי ולאקו-אימונולוגיה. השיטה מגבירה את הביטחון בניבוי מאפייני התגובה החיסונית, ומספקת בסיס לקבלת החלטות מותאמות סיכון במסלולי גילוי המערבים מודלים של חרקים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשרת בחינה של מגוון ותפקוד של תאי חיסון בחרקים במינים שאינם מיני מודל.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים (biological de-risking) באמצעות מתן גישה לתאי חיסון ראשוניים למחקרים מכניסטיים.
- מאפשר תיקוף תפקודי של מטרה באמצעות בדיקות אימונולוגיות של שלבי המשך.
- משפר את הביטחון החזוי בהיפותזות של תגובה חיסונית במחקרים המבוססים על חרקים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין דגימות המוציטים מאוששות עבור בדיקות חיסוניות כמותיות ותפקודיות.
- מבצע סטנדרטיזציה של מיצוי וספירת תאים, ובכך תומך בחזרתיות בין ניסויים.
- מאפשר הכנה בקנה מידה רחב של המוציטים לצורך סריקת השפעות של פתוגנים או תרכובות.
- מספק מספר תאים מהימן לצורך נורמליזציה של הבדיקה וניתוח השוואתי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- עולה בקנה אחד עם מחקרי אקו-אימונולוגיה (eco-immunology) בכך שמאפשר ביצוע פרופיל חיסוני באוכלוסיות בר.
- תומך ברצף מהאיסוף בשטח ועד לבדיקות תפקודיות מבוססות מעבדה.
- מקל על קידום מותאם סיכון של מודלים של חרקים למחקר תרגומי.
- מספק הפחתת סיכונים מנגנונית עבור מחקרים של מודיולציה חיסונית ואינטראקציה עם פתוגנים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
פרוטוקול מיצוי ההמוציטים הזה מתאים לממשק שבין השלב המוקדם של הגילוי לפיתוח הבדיקה, ומאפשר מחקרים של תאי מערכת החיסון המונחים על ידי היפותזה במודלים של חרקים ברים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות על גיוון ותפקוד של תאי מערכת החיסון בחרקים שאינם אורגניזמי מודל.
- סריקה: מספקת תכשירי המוציטים (hemocytes) כמותיים וסטנדרטיים עבור מבחני חיסון המשכיים.
- אנליזה: מספקת ספירות תאים ונתונים מורפולוגיים להשוואת תגובות חיסוניות בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מגשר בין איסוף מהשטח לבין אפיין חיסוני במעבדה עבור מחקרי אקו-אימונולוגיה ומחקרים השוואתיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פרוטוקול הניתן לשימוש חוזר וניתן להתאמה למינים שונים של פרפרים (lepidopteran) ומיני חרקים קרובי משפחה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי במחקרי תאי מערכת החיסון ומפחית עמימות מכניסטית באימונולוגיה של חרקים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של מיצוי וספירת המוציטים עבור תהליכי עבודה הניתנים לשחזור ולהרחבה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך או הפסקת ניסויים (go/no-go) במחקרי חיסון מבוססי חרקים ובמסלולי עבודה של אקו-אימונולוגיה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים של מודלי חרקים למחקרים פונקציונליים וטרנסלציונליים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בחרקים ובטכניקות של מיקרו-דיסקציה.
- נדרשת גישה למיקרוסקופי דיסקציה ומיקרוסקופים קומפיונדים, המוציטומטרים וכלים סטריליים.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין צוותים עבור פרוטוקולי איסוף דגימות וספירת תאים.
- ניתן להתאמה למינים שונים של פרפרים וחרקים קרובים באמצעות שינויים קלים.
- תנובת הדגימה וחיוניות התאים עשויות להשתנות בהתאם למין ולשלב ההתפתחותי.
