PCR מבוסס genotyping שיטה להבחין בין זנים wild-type ו נוי של Imperata cylindrica

המטרה העיקרית של הליך זה היא לספק פרוטוקול גנוטיפ פולרי מהיר וחסכוני, המסוגל להבחין בין זנים של Retta cylindrica, המכונה בדרך כלל gon grass, שאינם ניתנים להבחנה על בסיס מורפולוגיה בלבד. דבר זה מושג תחילה על ידי זיהוי ובידוד רקמה מזן gon grass רלוונטי. השלב הבא הוא מיצוי DNA גרעיני ופלסמי מהרקמה שנאספה.

בשלב הבא, תגובת שרשרת פולימראז (PCR) מבוצעת על ה-DNA שהופק, תוך שימוש בפריימרים ספציפיים לזן המכוונים להבדלי רצפים באזור ה-turn LF של ה-PLAs, וכן בבקרה חיובית ושלילית מתאימות. השלב הסופי הוא ביצוע אלקטרופורזה בג'ל עבור כל אחת מארבע תגובות ה-PCR כדי להנחית ולהדגים את תוצרי ה-PCR שהוגברו. בסופו של דבר, נקבע הזן של דשא הגון (gon grass) שנאסף באמצעות ניתוח של פסי תוצרי ה-PCR הספציפיים לזן שהתקבלו בג'ל. צמחים פולשים עולים לארצות הברית כ-3.4 מיליארד דולרים מדי שנה, וגורמים לנזק משמעותי הן למשאבים חקלאיים והן למשאבים טבעיים.

הסוג הפראי של *Imperata cylindrica*, המכונה גם דשא קוגן (Cogan grass), נחשב לאחד מעשרת העשבים הפולשים הגרועים ביותר בעולם. דשא קוגן מתפשט במהירות ומקים אוכלוסיות מונו-ספציפיות הדוחקות צמחייה מקומית, ובכך משפיעות על בעלי החיים התלויים בצמחייה זו. דשא קוגן פולש כיום ל-490 מיליון דונם ברחבי העולם ולכ-500,000 דונם בארצות הברית. זן נושאי של *I. cylindrica* משווק באופן נרחב תחת השמות *I. cylindrica*, Arbra, Red Baron ודשא דם יפני, אליו נתייחס כ-JBG. זן זה נחשב כסטרילי ולא פולשני, והוא מבוקש בשל עלייו בעלי הגוון האדום.

בתנאים מסוימים, דשא דם יפני יכול להפיק זרעים חיוניים ולחזור לצורה ירוקה לחלוטין שאינה ניתנת להבחנה מדשא קוגן מסוג בר. כפי שניתן לראות, לשניהם יש עלים ירוקים והם גדולים יותר מהזן הדקורטיבי המסורתי ובעלי עלים גדולים יותר. בנוסף, לצמחים שחזרו לצורתם המקורית ולצמחים מסוג בר יש רזומות גדולות יותר, מה שמגדיל את הפוטנציאל לרבייה אל-מינית של הזן הדקורטיבי.

הנסיגה הופכת את הזיהוי למבוסס על מורפולוגיה בלבד. זוהי משימה מאתגרת. שיטות מולקולריות מספקות אמצעי להבחנה מדויקת בין צמחים פולשים לבין חומרי צמחים שלא ניתן לזהות באמצעים חזותיים רגילים.

שיטות מולקולריות הן קריטיות להגנה מפני התפשטות והחדרה של צמחים פולשים. יישום פרוטוקול מולקולרי זה מספק אמצעי להבחנה מדויקת בין צמחי Japanese blood grass שהחזירו את תכונותיהם המקוריות לבין Kogan grass. פרוטוקול זה עשוי לסייע במניעת הופעה משותפת עם Kogan grass ומניעת אפשרות להיווצרות של היברידים בעלי יכולת השרדה.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני טכניקות קיימות, כגון פולימורפיזם של אורכי מקטעים מוגברים (AFLP) או ריצוף DNA, הוא שהיא מספקת שיטה יעילה כלכלית ומהירה לטיפוס גנטי מולקולרי, שיכולה להבחין בקלות בין דגמי בר של kogan grass לבין זנים של Japanese blood grass. את הטכניקה ידגים ג'וזף הרי, סטודנט לתואר ראשון מהמעבדה שלנו. ראשית, זהו דגימה מאתר שבו גדלים kogan grass או Japanese blood grass ויש צורך להבדיל ביניהם.

ניתן להבדיל בקלות בין דשא דם יפני לבין דשא קוגן מסוג פרא באמצעות העלים האדומים הבוהקים שלו. עם זאת, דשא דם יפני שהחזר את תכונותיו (revert) כמעט ואינו ניתן להבחנה מדשא קוגן, שכן לשניהם עלים ירוקים ארוכים יותר, שטח עלים גדול יותר וריזומות גדולות יותר מאשר לדשא דם יפני דקורטיבי. ניתן להשתמש בשיטה זו על רקמות עלים טריות, קפואות וכאלה שיובשו לאחרונה.

אם מאחסנים רקמות לצורך הפקת DNA במועד מאוחר יותר, השיטה הטובה ביותר היא להקפיא ולאחסן את הרקמה בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס באופן מיידי. אם נדרש אחסון יבש, יש להניח את הרקמה במעטפת נייר ולאחסן את המעטפת בסיליקה ג'ל מיובשת או בחומרים מייבשים פעילים אחרים בטמפרטורת החדר. אם נעשה שימוש ברקמה טרייה, יש לוודא כי ה-DNA מופק תוך שלוש שעות מהאיסוף כדי למנוע דה-גרדציה.

נוהל זה משתמש בערכה קטנה (mini kit) של DNEZ plants מבית Kyogen בהתאם להוראות היצרן עם שינוי מינורי אחד. הנוהל הותאם כך שישמשו יותר מ-100 milligrams של רקמה טרייה או קפואה, או יותר מ-20 milligrams של רקמה מיובשת. ראשית, גרסו יותר מ-100 milligrams של רקמת עלה טרייה או קפואה, או יותר מ-20 milligrams של רקמת עלה יבשה, לאבקה דקה באמצעות שלושה סבבים של חנקן נוזלי תוך써 גרס במכתש ועלי פיתה מקוררים.

שקלו את האבקה הקפואה מרקמה טרייה או קפואה למנות של 100 milligram. במידה שמשתמשים ברקמת עלים יבשה, שקלו את האבקה למנות של 20 milligram. לאחר שלב זה, המשיכו במיצוי ה-DNA בהתאם להוראות היצרן תוך שימוש בספקטרופוטומטר, כגון בדיקת NanoDrop spectrophotometer; תנובות DNA איכותיות בכמות טובה צריכות להיות בין 50 ל-150 nanograms per microliter, עם יחסי 260/280 ו-230/280 קרובים ל-2.0, כפי שניתן לראות כאן.

בצעו אלקטרופורזה באמצעות ג'ל 1%AROS סטנדרטי. ודאו את נוכחותן של פסים גדולים יחסית, הגדולים מ-10 KB, עם מעט או ללא מריחה הנובעת מזיהום RNA; אם ריכוז ה-DNA גבוה, דללו את הדגימות ל-70 nanograms per microliter עבור השלבים הבאים. הפריימרים ל-PCR המשמשים בפרוטוקול זה, המסומנים בחצים האדומים והירוקים, מבוססים על הבדלי רצף בין אזור המרווח LF (plastered turn LF spacer region) של גנוטיפים של Cogan grass ו-Japanese blood grass.

הבדלים אלו מופיעים כפולימורפיזם של נוקליאוטיד בודד (SNP) והכנסות ומחיקות (insertions and deletions), המסומנים בחצים שחורים אנכיים, ואשר מאפשרים פיתוח של פריימרים ספציפיים לזן. על ידי מיקום הפריימרים באתרים של רצפים ייחודיים, רצפי הפריימרים מופיעים בחלק הכתוב של הפרוטוקול עבור כל דגימת DNA מבודדת. הכינו שתי תגובות PCR בנפח של 50 µL בתוך מבחנות PCR בעלות דופן דקה בנפח 0.2 mL על קרח, תוך שימוש בכל סט פריימרים בהתאם לפרוטוקול הכתוב. אם ריכוז ה-DNA נמוך, ניתן להוסיף יותר DNA לכל תגובה תוך התאמת כמות המים הזיקוקים הכפולים נטולי הנוקליאז, כך שנפח התגובה הכולל יישאר 50 µL.

אין להשתמש ביותר מ-5 µL של DNA או ב-10% מהנפח הכולל לכל תגובה, שכן זיהומים המכילים את דגימות ה-DNA עלולים לעכב תגובות PCR; כדי להבטיח שכל ריאגנטי ה-PCR פועלים, יש להכין ביקורת חיובית. בעזרת הפריימרים של הביקורת החיובית, הכינו את הביקורת השלילית באמצעות אותה מערכת פריימרים של הביקורת החיובית, אך עם מים מזוקקים פעמיים במקום ה-DNA שחולץ; בשלב זה, ישנם בסך הכל ארבע תגובות PCR עבור כל דגימה שנבדקת. לאחר מכן, בצעו הגברה ב-PCR בתרמוסייקלר (thermocycler) המצויד במכסה מחומם, תוך שימוש בפרמטרי מחזור ה-PCR המופיעים בפרוטוקול הכתוב; ייתכן שיהיה צורך באופטימיזציה של טמפרטורת ההישמט (annealing) של הפריימרים, זמני ההארכה ומספר המחזורים, בהתאם לאיכות ה-DNA, לפריימרים, לפולימראז או לסוג התרמוסייקלר שבו נעשה שימוש.

לאחר השלמת תגובות ה-PCR, הפר את תוצרי ה-PCR על ג'ל 1% באמצעות אלקטרופורזה סטנדרטית. הרץ את הדגימות במתח של כ-120 וולט עד שחזית ה-D תגיע לשלושה רבעים מאורך הג'ל הכולל. הדמיין את הג'ל תחת אור UV ובדוק את הפסים שהתקבלו כדי לראות אם מקטע DNA מתאים הוגבר.

ג'ל מייצג זה מציג את תוצאות האלקטרופורזה של תוצרי PCR שהופקו מדגימות DNA של Kogan grass, Japanese blood grass ו-Japanese blood grass revert בשילוב עם פריימרים ספציפיים ל-Kogan grass ו-JBG, כמו גם בקרת חיוביות של turn LF ובקרת שליליות ללא תבנית (no template). סט הפריימרים של בקרת החיוביות turn LF פועל באותה יעילות עבור Cogan grass, Japanese blood grass, Japanese blood grass revert ודגשרי דשא אחרים, ויוביל להופעת פס באורך 890 base pairs. אם כל ריאגנטי ה-PCR נקיים מזיהומי DNA, תגובת בקרת השליליות לא תניב תוצר PCR.

אם דגימת ה-DNA מופקת מעשב קוגן מסוג פרא (wild type), תגובת PCR באמצעות מערכת הפריימרים הספציפית לעשב קוגן תניב פס בודד באורך של כ-595 זוגות בסיסים, בעוד שהפריימרים הספציפיים ל-JBG לא יניבו פס. באופן דומה, אם דגימת ה-DNA מופקת מ-JBG או מתגובת J-B-G-A-P-C-R שהוחזרה, שימוש במערכת הפריימרים הספציפית ל-JBG יניב פס בודד באורך של כ-594 זוגות בסיסים, בעוד שהפריימרים הספציפיים לעשב קוגן לא יניבו פס.

מכיוון של-JBG ול-JBG שהחזירו את תכונותיהם (reverted JBG) יש רצפי חומצות גרעיניות זהים, יהיו להם דפוסי רצועות זהים. עם זאת, ההבדלים המורפולוגים בין JBG לבין JBG שחזרו הם ברורים למדי, כך שבעוד שתוצאות ה-PCR יהיו זהות, ניתן להבחין בקלות בין זני ה-JBG ברמת הצמח. ריצוף DNA של תוצרי ה-PCR יכול לזהות שינויים אפשריים ברצפי ה-DNA עבור אקוטיפים שונים של cogan grass.

פיתוח טכניקה זו מספק את השיטה המולקולרית המפושטת הראשונה שיכולה להבחין במדויק בין סוג הבר (wild type) של K and grass לבין הצורה ההוזרת (reverted form) של זן הנוי שלו, Japanese blood grass. אנו מעודדים את המשתמשים בפרוטוקול זה ליצור איתנו קשר כדי לדווח על התוצאות שהתקבלו מהשימוש בפרוטוקול. שיתוף מידע זה יסייע באספקת נתונים על התפוצה של Japanese blood grass.

דבר זה יסייע גם למסמיחים ב-USDA לקבל החלטות מושכלות לגבי פעולות שעשויות להיות נחוצות כדי למנוע את התפשטותם ואת ההכלאה הפוטנציאלית של זני Cogan grass הפולשניים ביותר.