Assay Galvanotaxis לניתוח של קינטיקס נדידת תאים העצביים המבשר בשדה חשמלי נוכחי לשימוש חיצוני ישיר

המטרה הכללית של הליך זה היא להמחיש את נדירתן של תאי אב עצביים מהמבוגר בנוכחות שדה חשמלי עם זרם ישר. מטרה זו מושגת תחילה על ידי בידוד וגידול של תאי אב עצביים סוב-אפנדימליים מעכבר בוגר. השלב הבא הוא הכנת תאי Galvan Axxis והעברת תאי האב העצביים אל התאים.

השלב הסופי הוא הפעלת שדה חשמלי של זרם ישר על פני תא ה-Galvan Axxis וביצוע דימוי time-lapse כדי לצפות בנדידת התאי הקדמיים העצביים (neuro precursors). בסופו של דבר, מיקרוסקופיית ה-time-lapse לוכדת את תכונות הגלוואנטקסיס (Galvan tactic) של התאים הקדמיים העצביים במצבם המובהן והבלתי-מובהן. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי גלוואנוטאקסיס של תאים קדמיים עצביים, ניתן להחילה אותה גם על מערכות אחרות, כגון מודל שבץ בעכברים לגיוס תאים קדמיים עצביים לאתרי נגעים כדי לשפר את השיקום העצבי.

את הפרוצדורה יעמיד על כבודו Rob Pilley Post, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. עם תחילת הפרוצדורה, ה-NPCs חייבים להיות בתרבית במשך שבעה ימים, כך שכדוריות עצביות ראשוניות (primary neurospheres) צפות יהיו מוכנות לאספקה. בעת הצורך, התחילו בהכנת שלוש תאי Galvan Axxis על ידי הנחת שלוש זجاجות ריבועיות.

ראשית, השקיעו זלגיות (cover slips) בבקבוק המכיל 6N hydrochloric acid למשך לילה. בשעות הבוקר המוקדמות למחרת, הניחו את ה-matra gel להפשרה איטית על קרח. לאחר ארבע שעות, הוא יהיה מוכן לשימוש לבניית התא.

ראשית, השתמשו בחותך זכוכית בעל קצה יהלום כדי לחתוך שש רצועות זכוכית מלבניות מריבוע חדש. מספר אחת, כיסויי זכוכית (coverslips). העבירו את כיסויי הזכוכית הריבועיים והרצועות המלבניות, ששטופים בחומצה, אל מ 빠르게 זרימה למינרית (laminar flow hood).

שטוף את רצועות הזכוכית ב-70% ethanol ולאחר מכן במים שעברו אוטוקלאב בדרגת תרבית רקמות. הנח להן להתייבש באוויר או ייבש אותן על נייר נקי מסדקים (lint-free).

צלחות פטרי. מרחו גריז ואקום על צד אחד של רצועות הזכוכית המלבניות והדביקו אותן לקצוות הנגדיים של הריבוע. השתמשו בעגילות זכוכית כדי ליצור ריבועים עם תעלה מרכזית במרכז כל צלחת.

בצעו סטריליזציה ב-UV לריבועי הזכוכית או לתאות המודעות הללו למשך 15 דקות לפחות תחת מנשף. לאחר מכן, העבירו בפיפטה 250 עד 300 µL של polyol lysine אל תוך השקע המרכזי של התאות. לאחר מכן, הדגירו את התאות בטמפרטורת החדר למשך שעתיים, בערך 15 דקות לפני סיום ההדגרה.

הכינו את תמיסת ה-matrigel לאחר שעתיים, שאבו את ה-poly-L-lysine ושטפו את התעלות המרכזיות עם 1 mL של מים שעברו אוטוקלאב. לאחר מכן, טפטפו באמצעות פיפטה 250 עד 300 µL של תמיסת matrigel אל התעלות המרכזיות והדגרימו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה. לאחר ההדגרה, שאבו את תמיסת ה-matrigel.

לאחר מכן, שטפו בעדינות את התעלות המרכזיות עם 1-2 milliliters של SFM. כעת, העבירו בפיפטה 100 microliters של E-F-H-S-F-M או F-B-S-S-F-M אל התעלות המרכזיות כהכנה לתאי התרבית. לאחר מכן, העבירו בפיפטה 4-5 milliliters של תרבית המכילה neurospheres אל צלוחית פטרי חדשה בקוטר 60 millimeter.

לאחר מכן, הניחו את צלחת הפטרי על הבמה של מיקרוסקופ הספירה תחת עדשת התצפית של 5x. השתמשו בפיפט P10 כדי להעביר בעדינות חמישה עד שמונה נוירוספרות שלמות אל התעלה המרכזית של כל תא. עד ארבעה.

ניתן להעביר את הנוירוספירות בבת אחת, אך אין להפריד אותן מהנוירוספירות הנמצאות בתעלות המרכזיות. פזרו אותן בזהירות מסביב מבלי להפר את תשת המטריגל. לאחר מכן, הוסיפו 150 µL נוספים של E-F-H-S-F-M או F-B-S-S-F-M אל התעלות המרכזיות.

כעת יש לגדל את התאים באינקובטור עם לחות. לאחר 17 עד 20 שעות של תרבית, NPC שאינם מובחנים יהיו זמינים לאחר 69 עד 72 שעות. בתרבית, NPC מובחנים יהיו זמינים.

תחת מיקרוסקופ ספירה, בחרו את התא עם התאים הטובים ביותר לניתוח נדידה של דימוי תאים חיים. התאים צריכים להיות עגולים, כמעט מנותקים לחלוטין מהנוירוספירות שלהם, וכאלה שטרם החלו, או רק החלו, להוציא שלוחות תחת מנדף. הכינו כיסוי לתא.

שטפו לבישת זכוכית ריבועית ב-70% ethanol, ולאחר מכן במים שעברו אוטוקלאב, ומריחו פס של גריז ואקום על שני קצוות מקבילים. כעת כסו את התא. ראשית, שאבו את מדיום התרבית מהתעלה המרכזית, ולאחר מכן סגרו במהירות את הלבישה על הדפנות המלבניות כגג.

בשלב הבא, באמצעות פעולת נימיות, טענו 100 µL של מצע טרי אל תוך התעלה המרכזית. כעת השתמשו בגריז ואקום כדי ליצור גבולות לבריכות של מצע תרבית. בכל קצה של התעלה המרכזית במערכת הדימוי של תאים חיים, הכינו מראש מבחנות ג'ל agarose, אלקטרודות כסף/כסוף כלוריד ושתי צלחות פטרי בקוטר 60 מילימטר לשימוש.

כדי שישמשו כמאגרי מצע גידול, השאירו את התאים לנוח בסביבה של 37 °C ו-5% carbon dioxide למשך 20 עד 30 דקות. במהלך זמן זה, הכינו את המכסים של שתי צלחות הפטרי הריקות ואת המכסה של צלחת הפטרי של תאי ה-Galvan Axxis על ידי קידוח חורים בהם באמצעות Dremel או כלי פיפט, שפכו 1.5 עד 2 mL של מצע לכל צד של התעלה המרכזית והוסיפו 7 עד 8 mL של SFM לכל צלחת פטרי ריקה. הניחו צלחת פטרי אחת בכל צד של התעלה המרכזית של התא והניחו אלקטרודה אחת בכל צלחת.

גשרו על הרווח שבין התא לבין פטריות הפטרי כדי ליצור רצף חשמלי. באמצעות גשרי ג'ל של Agros, חברו את האלקטרודות לספק כוח חיצוני עם מד M בטור למדידת זרם חשמלי, והפעילו את ספק הכוח. השתמשו במד מתח כדי למדוד את עוצמת השדה החשמלי ישירות לרוחב התעלה המרכזית.

כוון את פלט ספק הכוח לפי הצורך. כעת הפעל את מודול ה-time-lapse במערכת ההדמיה. בתוכנת Axio vision בחר ב-multidimensional acquisition ולחץ על see.

עבור הערוצים, בחרו בערוץ שש, ולחצו על T עבור צילום במרווחי זמן (time lapse). הגדירו את הגדרות מרווח הזמן לדקה אחת, ואת משך הזמן לשמונה שעות בשדות ההגדרות לפני ואחרי נקודת הזמן; בחרו את נקודות הזמן שלפני ואחרי. כעת לחצו על start והמתינו עד להשלמת הניסוי למשך הזמן הרצוי. לאחר סיום הבדיקה, המשיכו לניתוח IHC.

ניתוח קינמטי העלה כי בנוכחות DCEF בעוצמה של 250 millivolt per millimeter, NPCs לא מובחנים מראים ציר גלווני מכוון ומהיר מאוד לעבר הקתודה; בעוצמת שדה זו, יותר מ-98% מה-NPCs הלא מובחנים נדדו לאורך כל שש עד שמונה השעות שבהן הם דוגמו. בהיעדרו של A-D-C-E-F, נצפתה תנועה אקראית של התאים.

מאחר שתאים מתים אינם נודדים, הדבר מרמז כי הם נותרים חיוניים במהלך תקופה זו. בהיעדר או בנוכחות של A-D-C-E-F, פנוטיפים מובחנים הראו נדידה זניחה, הן בנוכחות והן בהיעדר תתי-אוכלוסיות של תאים מובחנים מסוג A-D-C-E-F. נצפו תהליכים מוארכים שנטו להיסדר בניצב לכיוון ה-DCEF, אך לא נצפתה העתקה מורגשת של גוף התא.

צביעה אימונולוגית איששה כי תאי NPCs שמרו על ביטוי חיובי של הסמן לתאי קדם עצביים nestin לאחר שש שעות של חשיפה ל-DC EF. בבדיקות שבהן הונחו NPCs להבדיל לפנוטיפים בוגרים, רוב התאים מבטאים את הסמן לאסטרוציטים בוגרים glial fibrillary acidic protein או GFAP לאחר שש שעות של חשיפה ל-DCEF. בעקבות הליך זה, ניתן להפיק תובנות לגבי המנגנונים התאיים המעורבים בהמרה של השדה החשמלי במזרם ישר לתנועתיות תאית באמצעות מודלים של נוק-אאוט גנטי.

או אדון, לדוגמה.