ניתוח של הגירה קרסט בידול עצבית ועל ידי חוצה מינים להשתלות
7 בפברואר 2012
הגישה לניתוח הגירה גורלו הסופי של העופות לפסגה תאים עצביים שליו, חומוס עוברים chimeric מתואר. שיטה זו היא טכניקה פשוטה וישירה לאיתור תאים עצביים לפסגה במהלך הגירה והבחנה שקשה אחרת להבחין בתוך העובר גוזל unmanipulated.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשתיל רקמה גבייה של צינור העצבים (dorsal neural tube explan) מעובר של שליו לתוך עובר של תרנגולת בשלב התפתחותי תואם, וזאת כדי לעקוב אחר נדידתם וגורלם של תאי רכס העצבים (neural crest cells). פעולה זו מתבצעת תחילה על ידי פקיעה של חור קטן בממברנת ה-IGN של עובר התרנגולת המארח כדי להגיע לצינור העצבים. לאחר מכן, עובר השליו התורם מוצא מהביצה שלו כדי להכינו לחיתוך השתל.
בשלב הבא, מוציאים את אזור העניין מהצינור העצבי של העובר המארח. לאחר מכן, מוציאים אזור דומה מהצינור העצבי של התורם לצורך השתלה. לבסוף, משתילים את הצינור העצבי של התורם לתוך הצינור העצבי של המארח.
לבסוף, העובר הכימרי מדגיר עד לשלב הרצוי לצורך זיהוי תאי רב-עצב (neural crest) שהגיעו לאיבר הנבחר. בסופו של דבר, ניתן לדייק את נדידתם והבידול של תאי רב-עצב שמקורם בתורם למיקומים שונים בעובר המארח באמצעות מיקרוסקופיה של אימונופלואורסצנציה. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כיוון ששלבי המיקרו-דיסקציה וההשתלה דורשים מיומנויות מוטוריות עדינות מאוד, מה שהופך את למידתם לקשה.
התחילו בשטיפת לכלוך מביצי האפרוחים במים פושרים. סדרו את הביצים בצורה אופקית על מגש, ולאחר מכן סמנו בעיפרון את הצד הפונה כלפי מעלה כדי לציין את האזור שבו ימוקם העובר. להכנת עוברים תורמים בשיטת X ovo, הדגרירו את רגלי הסלוקיות כאשר הצד הקה פונה כלפי מטה.
בשלב הבא, הניחו את הביצים באינקובטור לח עם טמפרטורה של 38 °C והפעילו את פונקציית הניעור. לאחר סיום הדגירה, סטריליזו את החלקים העליונים על ידי ריסוס ב-70% ethanol ולאחר מכן ניגוב מהיר בעזרת Kim wipe. כדי למנוע ספיגה דרך קליפת הביצה, הניחו כל ביצה שעברה סטריליזציה על מעמד ביצים אישי, באופן דומה לצלחת הפטרי המרופדת ב-Kim wipes מקופלים המוצגת כאן. לאחר מכן, בעזרת פינצטה AA סטרילית, צרו חור קטן במשטח העליון של קליפת הביצה בקצה החד של הביצה.
ציידו מזרק של 5 mL במחט תת-עורית במידה 18.5. לאחר מכן, כאשר הצד החתוך של המחט פונה לקצה החד של הביצה, הכניסו את המחט בצורה אנכית אל החור בקליפת הביצה. כדי למנוע פגיעה מקרית בחלמון כתוצאה משאיבה, נקו את החור עם 70% ethanol כפי שבוצע קודם לכן, ואטמו את החור באמצעות סרט דביק.
לאחר מכן, באמצעות הפינצטה מסוג double A, פתחו חור נוסף במשטח העליון המסומן של הרגל האופקית, לא בדיוק בנקודת השיא. לאחר מכן, הכניסו צד אחד של פינצטת ה-iris העקלקית אל תוך החור, במקביל לביצה. לחצו על הקליפה והפעילו תנועה סיבובית.
פתחו חלון בקוטר שני סנטימטרים בקליפת ביצת התרנגולת, והשליכו את חלק הקליפה שהוסר. העובר אמור להופיע כדסקית עכורה בחלקו העליון של החלמון. השליכו כל ביצה שלא הופרת, אותה ניתן לזהות על ידי נקודה לבנה קטנה על פני החלמון או על ידי היעדר ה-blastoderm.
כעת, תוך끔 שימוש במיגון עיניים מתאים, כופפו מחט היפודרמית במידה 26.5 בזווית של 45 מעלות, החל מבסיס המחט. לאחר חיבור המחט הכפופה למזרק של 1 mL כאשר צד הפיה פונה כלפי מעלה, מלאו את המחט בדיו אינדיה (India ink) מדולל. נקבו את קרום החלמון מחוץ להיקף הבלסטודרם, והחליקו את קצה המחט מתחת לעובר, קרוב לפני השטח של החלמון, אך לא בתוך השכבות העובריות.
לאחר מכן, מזריקים כמות קטנה של דיו כדי לסמן את מתאר העובר, תוך הימנעות מהזרקת בועות אוויר. מושכים את המחט החוצה בזהירות. כעת משתמשים במיקרוסקופ סטריאו ובמקור אור בעל פליטת חום מוגבלת, כגון מנורת הסיב האופטי בעלת הצוואר הגמיש המוצגת כאן.
בצעו שלב של העוברים בהתאם למדד Hamburger and Hamilton. רשמו את השלב על קליפות הביצים. לאחר מכן, טפטפו שתי עד שלוש טיפות של תמיסת Ringer סטרילית וחמה על פני העוברים כדי למנוע התייבשות וזיהום.
לאחר מכן, מתחו פאראפילם (para film) מעל פני הביצים כדי לאטום זמנית את החלונות. בשלב הבא, הכינו את ביצי השלה להשתלה. לפני הוצאת הביצים מהדגרה, מלאו צלחת פטרי בתמיסת רינגר (ringer solution).
לאחר מכן, פתחו את הביצים בצד הקה בעזרת פינצטה מעוקלת כדי לחשוף את העובר. בעזרת מספרי דיסקציה, בצעו ארבעה חתכים בצורת ריבוע דרך קרומי הווילי (vili membrane) והבלאסטודרם (blaster derm) מחוץ לעובר, תוך וידוא שכל החתכים נפגשים. לאחר מכן, בעזרת פינצטת איריס מעוקלת, אחזו בעדינות באחד מקצוות החתך, הרימו את העובר מהביצה והעבירו אותו לצחנית הפטרי המוכנה.
לבסוף, הסירו בעדינות את הקרומי הויטליני באמצעות פינצטה מספר 5, ולאחר מכן קבעו את שלב ההתפתחות של העוברים תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי. הסירו את הפארא-פילם מעובר האפרוח המארח. לאחר מכן, באמצעות מחט טונגסטן מחודדת, פתחו חור קטן בקרומי ה-VII באזור הרצוי של צינור העצבים.
הוסף טיפה של תמיסת רינגר (ringer solution) לעובר. לאחר מכן, עבור השתלות חד-צדדיות, כזו המבוצעת בסרטון זה, השתמש במחט זכוכית משחזת כדי לבצע בזהירות חתכים רוחביים רוסטרליים (rostral) וקודאליים (cordal) באזור המוח האמצעי של צינור העצבים, מבלי לחרוג מהלומן (lumen). לאחר מכן, בצע חיתוך דו-צדדי בין צינור העצבים הדורסלי לבין המזודרם הפריאקסיאלי (paraxial mesoderm).
לבסוף, הפר בעדינות את ה-ex explan שנכרת מהצינור העצבי, ולאחר מכן הוצא אותו מהעובר על ידי שאיבה לתוך מיקרו-פיפטית מזכוכית. ראשית, השתמש בעובר של ברנשל תואם לגיל. לאחר מכן, כרט אזור מהצינור העצבי בגודל דומה לזה שהודגם זה עתה, ושאב את ה-X explan התורם לתוך מיקרו-פיפטית מזכוכית המכילה תמיסת Ringers.
העבר את ה-X explan לסמוך לאזור שהוצא מהאפרוח המארח. לאחר מכן, בעזרת מחט זכוכית דקה (pulled glass needle), כוון את ה-ex explan על ידי הובלה עדינה אל תוך האזור שעבר אבלציה. הוסף בזהירות מספר טיפות של תמיסת רינגר (ringer solution) לעובר כדי למנוע התייבשות.
לבסוף, אטמו את החלון בעזרת סרט דביק, תוך וידוא שהסרט אוטם את כל אזור החלון בביצה, והחזירו את הביצה לדגירה עד לשלב הרצוי. כבו את פונקציית הנדנוד בזמן דגירת הקיורות; ניתן לסובב את ה-X בעדינות ביד פעמיים ביום כדי להגביר את סיכויי ההישרדות שלהם. אם המטרה היא שלבי התפתחות מאוחרים יותר, תמונה מייצגת זו של האזור המושתל בצינור העצבי לאחר שש שעות של דגירה חוזרת עד לשלב HH 11, מראה את ההטמעה הצפויה של רקמת התורם של השל przerב (quail) המושתלת בתוך צינור העצבי של אפרוח המאחס. חתך רוחבי זה דרך האזור המושתל בשלב HH 11 מראה תאי רב-עצביות (neural crest) המסומנים ב-hnk, כאשר אחד מהם נודד לצדדים הרחק מהצינור העצבי.
תאי שלוה התורמים לזרם הנדידה של תאי הרבב העצבי, ולצינור העצבי, מסומנים בבירור באמצעות QCPN. בשלבים מאוחרים יותר, ניתן לעקוב אחר תאים שהתפתחו מתאי רבב עצבי של שלוה עד לרקמת היעד הסופית שלהם. כפי שניתן לראות באיור זה, תאים המסומנים ב-QCPN מפוזרים בתוך ה-meen chi של עובר אפרוח בתהליך הלסת העליונה (maxillary process). בשלב E5, ניתן לשלב בקלות את הנוגדן QCPN עם נוגדים אחרים כדי לבחון את הדיפרנציאציה של תאי רבב עצבי שמקורם בשלוה.
בסביבת המארח. כפי שניתן לראות כאן, נוירונים תחושתיים של עצב השלישייה שנגזרו מתאי רב-עצביים של שליו (quail) מסומנים על ידי נוגדני QCPN ו-T UJ one. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון אימונוהיסטוכימיה והיברידיזציה במקום (in situ hybridization) כדי לענות על שאלות נוספות, כגון לאילו רקמות מתפתחים התאים הרב-עצביים, ואילו גנים הם מבטאים בעודם מבדילים לרקמות שונות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה לניתוח הנדידה וגורלם של תאי רב-עצביים (neural crest cells) של עופות בעוברי כימרה של שליו ותרנגול. הטכניקה מאפשרת מעקב אחר תאים אלה במהלך נדידתם ודיפרנציאצייתם, דבר המהווה אתגר בעוברי תרנגול שלא עברו מניפולציה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- אמבריולוגיה
רקע
- תאי רב-עצביים (Neural crest cells) חיוניים להתפתחותן של מבנים שונים בחולייתנים.
- מעקב אחר נדידתם מסייע להבנת תפקידם בהתפתחות העוברית.
- עוברי כימרה מהווים מודל ייחודי לחקר גורל התא.
- שיטות מסורתיות עשויות שלא להבדיל ביעילות בין תאים אלו.
מטרת המחקר
- פיתוח טכניקה פשוטה למעקב אחר תאי רב רבדיים (neural crest cells).
- ניתוח דפוסי הנדידה של תאים אלו בסביבה מבוקרת.
- שיפור ההבנה של תהליכי ההבדלה של תאי רב רבדיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- השתרה של תרבית (explant) מהצינור העצבי הגבי של עובר שלו בהוואי לתוך עובר של תרנגולת.
- יצירת חור קטן בממברנה של ה-IGN בעובר המארח לצורך גישה.
- חליצה של אזורי עניין הן מעובר המארח והן מעובר התורם.
- השתלה של הצינור העצבי של התורם לתוך הצינור העצבי של המארח.
תוצאות עיקריות
- השיטה עוקבת בהצלחה אחר נדידתם של תאי הרב רשת העצבית (neural crest cells).
- עוברי כימרה מראים דפוסי בידול ברורים.
- התוצאות מעידות על היתכנותה של טכניקה זו למחקרים עתידיים.
- יישומים פוטנציאליים להבנת הפרעות התפתחותיות.
מסקנות
- טכניקה זו מספקת שיטה מהימנה לחקר הדינמיקה של תאי הרב נרב (neural crest cells).
- היא פותחת אפשרויות למחקרים נוספים בביולוגיה של ההתפתחות.
- מחקרים עתידיים יוכלו להתבסס על שיטה זו כדי לחקור תופעות קשורות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
השתלה של צינור עצבי בין מינים בעוברים של עופות מאפשרת מעקב מדויק אחר שושלות ומיפוי גורל של תאי רגב עצבי, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטית בשלבי הגילוי המוקדמים. גישה זו מספקת תובנות ברזולוציה גבוהה לגבי נדידת תאים,התמיינות ותבניתיות מוקדמת, המכוונות אסטרטגיות של תיקוף מטרות ומידול מחלות. הסתגלנותה של השיטה ותשומותיה הכמותיות ממצבים אותה כפלטפורמה רב-פעמית עבור ביולוגיה התפתחותית ומסלולי מחקר תרגומיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של היפותזות התפתחותיות באמצעות מעקב אחר נדידה וגורל של תאי רב רכמיים (neural crest cells).
- תומך בהסרת סיכונים ביולוגיים באמצעות ויזואליזציה ישירה של שושלת תאים ותוצאות התמיינות.
- מסייע בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי חשיפת דפוסי עיצוב מקדימים (pre-patterning) ספציפיים לאזור והשפעות סביבתיות.
- מספק ביטחון חיזוי לצורך תעדוף תיקי פיתוח על ידי הבהרת מנגנוני התפתחות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מערכות כימריות עוברות תיקוף עבור סריקת פנוטיפ ומחקרי הפרעה (perturbation) בהמשך התהליך.
- מסטנדרט את בדיקות מיפוי הגורל באמצעות סימון ספציפי למין ופרוטוקולי השתלה הניתנים לשחזור.
- מאפשר הערכה כמותית של נקודות קצה של נדידה ודיפרנציאציה באמצעות אימונופלורסצנציה וסמני נוגדנים.
- תומך בהתאמה ניתנת להרחבה (scalable) לסריקת תרכובות או הפרעות גנטיות בהקשרים התפתחותיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- תואם למודלים רלוונטיים למחלות על ידי מתן אפשרות למניפולציה של סביבות תאי רב השבטים (neural crest) ורקעים גנטיים.
- מספק רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות תוצרי מיפוי גורל ומעקב אחר שושלות תאים.
- מפחית סיכונים בקידום תרגומי על ידי הבהרת התרומות של סוגי תאים שונים לאורגנוגנזה ולתבניות התפתחותיות.
- תומך בזיהוי סמנים ביולוגיים על ידי שילוב מעקב אחר תאים עם אימונוהיסטוכימיה ואנליזת ביטוי גנים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
שיטה זו להשתלה ומעקב משלבת שלבים החל מהגילוי המוקדם ועד למחקר פרה-קליני, ובכך היא תומכת בבדיקת היפותזות, הפחתת סיכונים מכניסטיים והמשכיות תרגומית.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקה מונחית-היפותזה של מקור, נדידה וגורל של תאי הרכס העצבי (neural crest) במערכת מבוקרת.
- סריקה: מספקת מודלים כימריים סטנדרטיים וניתנים לשחזור לצורך הערכת הפרעות גנטיות או מולקולריות.
- אנליטיקה: מספקת תוצאות כמותיות באמצעות אימונופלואורסצנציה וזיהוי תאים מבוסס נוגדנים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין מעקב אחר שושלות התפתחותיות לבין מידול מחלות וגילוי סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה גמישה וחסכונית הניתנת להתאמה למספר מינים ולשאלות ניסוייות שונות.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות התפתחותיות.
- ערך תפעולי: מספק תהליכי עבודה סטנדרטיים, ניתנים לשחזור וניתנים להרחבה להשתלה ומעקב.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשכיות הפרויקט (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי הבהרה מוקדמת של מנגנוני התפתחות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים וקידום של מטרות ומודלים הרלוונטיים למחלה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות של מיקרו-דיסקציה והשתלה עוברית.
- נדרשת גישה לתשתית של סטריאומקרוסקופיה, אימונופלואורסצנציה וסימון בנוגדנים.
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים לצורך הדירות והשוואתיות של הנתונים.
- ניתן להתאמה למערכות מודל של עופות ומערכות נבחרות של יונקים ליישום רחב יותר.
- מוגבל על ידי דרישות מיומנות טכנית ותאימות מינים עבור השתלת כימרות.
