טיהור וצבירה של תחום החלבון המבשר עמילואיד התאי

מטרת הליך זה היא לטהר את הדומיין התו-תאי של חלבון המקדימה לאמילואיד, הידוע גם כ-A ICD, ולהציג פרוטוקול לצבירה תרמית ולאפיון של A ICD באמצעות מיקרוסקופיית כוח אטומי. הדבר מושג תחילה על ידי ביטוי של איחוי A GST של A ICD בחיידקים. לאחר מכן, חלבון ה-G-S-T-A-I-C-D מטהר ונחתוך באמצעות תרומבין כדי להפריד את ה-GST מה-A ICD, וה-GST מוסר.

לאחר מכן, מושרה אגרגציה תרמית של A ICD. לבסוף, המצבורים של A ICD מדויקים באמצעות מיקרוסקופיית כוח אטומי. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות כי ניתן לטהר את A ICD להומוגניות בכמות המספיקה לניתוח ביוכימי וביופיזיקלי.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, הדורשות שלבי כרומטוגרפיה מורכבים, הוא קבלת תוצר טהור ומסיס מאוד. ניתן לבודד ICD על גבי ספת המעבדה תוך שימוש בריאגנטים ובציוד סטנדרטיים. ICD המופק באמצעות פרוטוקול זה מתאים לאפיון ביוכימי וביופיזיקלי נוסף.

אמינה טי תדגים את הפרוצדורה. ד"ר אנדרס אוברר, פוסט-דוקטור לשעבר במעבדתי, ידגים כיצד לבצע דימות באמצעות מיקרוסקופיית כוח אטומי של A ICD. כדי לבטא את הדומיין התוך-תאי הרקומביננטי של A PP או A ICD, התחילו עם תאי BL 21 שעברו טרנספורמציה עם וקטור pgx 41, הנושא את A ICD האנושי המחובר לקצה ה-C של GST; עם מושבה בודדת, חדיעו 10 milliliters של תרשוף LB עם אמפיצילין והדגירו למשך לילה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עם ניעור חזק למחרת בבוקר.

דגרו 400 milliliters של LB ampicillin בבקבוק של one liter יחד עם five milliliters של תרבית הלילה. דגרו ב-37 degrees Celsius עם ניעור חזק עד שהצפיפות האופטית ב-600 nanometers תגיע ל-0.4 עד 0.6. תהליך זה יארך בדרך כלל two עד 2.5 hours כדי להשרות את הביטוי של G-S-T-A-I-C-D.

הוספנו 0.4 millimolar של IPTG והדגרנו בטמפרטורה של 37 °C עם ניעור חזק למשך חמש שעות. סבבנו את התאים בצנטריפוגה ב-6,000 ×g למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 °C ואחסנו את המשקע במינוס 80 °C. לאחר הכנת באפר ליזיס והנחת הבקטריות על קרח, הוספנו 20 milliliters של באפר למשקע וערבבנו ביסודיות באמצעות שילוב של וורטקס וערבוב עם פיפטה על קרח.

שעלק את משקע החיידקים והעבר את הליזט החיידקי השעולק דרך אמולסייזר או מכבש פרנץ' (French press) שקוררו מראש. בלחץ של 30,000 PSI העבר את הליזט דרך האמולסייזר פעם שנייה ואסוף את הליזט למבחנה של 50 milliliter שקוררה מראש. סבב את הליזט בצנטריפוגה ב-15,000 ×g ובטמפרטורה של 4°C למשך 30 דקות.

הפרידו והעבירו את העליון למבחנה של 50 milliliter שקולל מראש. הוסיפו 500 microliters של slurry בריכוז 50% של glutathione agarose. סובבו במשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע degrees Celsius בזמן שהדגימה מסתובבת.

הכינו תמיסת אלוציה טרייה לאחר הדגירה. שפכו את הליזט והסלרי (slurry) לתוך עמודת כרומטוגרפיה חד-פעמית מפוליסטירן בגודל חמישה אינץ' עם מסננים גסים. שטפו את העמודה חמש פעמים עם 3 mL של PBS.

סגרו את תחתית העמודה והוסיפו 500 µL של תמיסת אלוציה (elution buffer) בטמפרטורת החדר. סגרו את חלקו העליון של העמודה וסובבו למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. אספו את התסננת הראשונית לתוך מבחנה מיקרו-צנטריפוגית מקוררת בנפח 1.5 mL.

חזור על תהליך האלוציה פעמיים נוספות. בצע דיאליזה לתמיסת האלוט בעזרת ממбраנת דיאליזה עם סף חיתוך של 10,000 משקל מולקולרי בארבעה ליטרים של PBS למשך לילה בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס. למחרת, בצע דיאליזה כנגד ארבעה ליטרים נוספים של PBS בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.

הוצא את החלבון מקסטת הדיאליזה ובצע בדיקת כימות חלבון כדי לקבוע את התבלה של G-S-T-A-I-C-D. טיהור טיפוסי מ-400 milliliters של תרבית יניב תבלה של יותר מ-20 milligrams של חלבון מטוהר בריכוזים של 10 עד 20 milligrams per milliliter. חלק את החלבון לאליקווטים של 200 microliter, והקפא בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius.

כדי לשחרר את ה-A ICD ממיזוג ה-GST, קחו 200 µL של G-S-T-A-I-C-D מטוהר והוסיפו 20 µL של thrombin בריכוז של יחידה אחת ל-µL; דגרו למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C. למחרת, הסירו חומרים מצברים באמצעות סנטריפוגציה ב-20,000 ×g למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 °C. העבירו את העליליות (supernatant) למבחנה מיקרו-צוננת כדי להסיר את ה-GST וה-thrombin. הוסיפו 50 µL של glutathione aro slurry בריכוז של 50% ו-50 µL של p and wino zaine aro slurry בריכוז של 50%, בהתאמה.

דגרו עם סיבוב למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. סובבו בצנטריפוגה למשך זמן קצר כדי לשקע את ה-agro beads והעבירו את הנוזל העליון למבחנה נקייה. חלצו את ה-GST ארבע פעמים נוספות באמצעות glutathione.

בצעו בדיקה לכימות חלבון על חמישה מיקרוליטרים של A ICD מטוהר. תנובות טיפוסיות מתוך תרבית של 400 מיליליטר מניבות 50 עד 100 מיקרוגרמים בריכוז של 0.2 עד 0.5 מיליגרם למילליטר. לאחר דילול של A ICD שהוכן טרי ב-PBS לריכוז של 0.1 מיליגרם למילליטר, הושרה אגרגציה תרמית על ידי דגירה של הדגימות בטמפרטורה של 43 °C במהירות של 800 RPM בשייקר מחומם למשך 48 שעות.

דללו את הדגימה פי 20 במים דה-יוניזציה והניחו שתי מיקרוליטרים על מיקה ששודפה לאחרונה. ייבשו את הדגימה בתוך דסיקטור למשך לילה כדי להנמיח את ה-Aβ ICD המצטבר. השתמשו במיקרוסקופיה של כוח אטומי (AFM) במצב tapping עם קנטילברים של nitride עם ציפוי זהב ורדיוס קצה נומינלי של 2 ננומטרים.

משרעי נקישה טיפוסיים במהלך הדמיה, 10 עד 20 nanometers בתדר התהודה של הזרועות. הביטוי וההעשרה היחסיים של G-S-T-A-I-C-D מוצגים כאן. לאחר ליזיס, רוב חלבון היתוך נמצא בחלק המומס, ולכן אין צורך בחילוץ מגופי הכללה (inclusion bodies).

החומר שסנפח מעמודת ה-glutathione היה בטוהר של מעל 95%. בהכנה המוצגת כאן, ריכוז החלבון שסנפח מהעמודה היה 14.5 milligrams per milliliter, והתנובה הייתה 22 milligrams. שבירה של 200 microliters מהכנה זו למשך לילה עם 20 units של thrombin הביאה לשבירה של כמעט 100% מחלבון היתוך (fusion protein).

כמות הטורבין שבה נעשה שימוש נמוכה מספיק כדי שלא תהיה ניתנת לגילוי באמצעות kumasi. צביעה בכחול, והסרה של הטורבין וה-GST, הובילו לאובדן מסוים של חומר. עם זאת, רמת הטוהר הייתה גבוהה מ-90% עם תפוקה בהכנה זו של 70 micrograms של A ICD בריכוז של 0.35 milligrams per milliliter.

מקבצי A ICD, שצולמו באמצעות FM, הם בדרך כלל סטרואידים אמורפיים וגודלם נע בין 50 ל-100 ננומטרים. חומר מצבר אינו ניתן לזיהוי כאשר מתווספת כמות שוות-מולרית של השפראון UBI Quillin one לתגובת ההצטברות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לך הבנה טובה כיצד לטהר EICD, להשרות את הצטברותו ולדמות את המקבצים באמצעות A-F-M-E-I-C-D.

חומרים שזוהו וטוהרו בטכניקה זו יכולים להיות מיושמים בשיטות אחרות, כגון פיזור אור ומבד hoped-filter trap, כדי לענות על שאלות בנוגע להשפעתם של מלווים מולקולריים (molecular chaperones) על אגרגציה של EACD.