הבחנת תפקידים פונקציונליים של ביטוי גנים מתאים חיסוניים וללא חיסון בקוליטיס המאוס על ידי השתלת מח עצם
1 באוקטובר 2012
השתלת מח עצם מספקת דרך לשנות את הגנוטיפ של תאים שמקורם במח עצם. אם הגן של העניין בא לידי ביטוי בשני תאי מח עצם ותאים שמקורם במח שאינם נגזרים עצם, השתלת מח עצם יכולה לשנות את התאים שמקורם במח עצם לגנוטיפ שונה מבלי לשנות את גנוטיפ התאים לא נובע מח העצם.
המטרה הכללית של הניסוי המודגם בסרטון זה היא להעריך האם הפפטיד האנטי-מיקרוביאלי lyin ממלא תפקיד בשיפור קוליטיס המושרה על ידי dextran sulfate בעכברים. דבר זה מושג על ידי הזרקת מחול השראה מעכברי wild type לעכברי licit ועכברי knockout מקרינים, והזרקת מחול השראה מעכברי knockout לעכברי wild type מקרינים. מחול ההשראה המושתל יייצר תאי דם חדשים אצל המקבל בעלי הגנוטיפ של התורם.
לאחר ארבעה שבועות, העכברים המקבלים נחשפים לדקסטראן סולפט כדי להשרות קוליטיס. הצלחת השתלת התאים מאומתת באמצעות ציטומטריה זרימה, ונזק לרקמת המעי הגס מוערך באמצעות היסטולוגיה. התוצאות המתקבלות מראות כי הקוליטיס מיתנה כאשר מחלס עצם מסוג wild type מושתל בעכברי knockout.
מנגד, הקוליטיס מחמירה כאשר מחולל עצם של עכברי knockout מושתל בעכברי wild type. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בקביעת ביטוי הגנים מתאי מחולל עצם או מתאים שאינם ממקור של מחולל עצם בדלקת או בזיהום. לניסוי זה מומלץ להשתמש בעכברי C 57, black six, wild type, ועכברי C elicited knockout, כדי לאפשר מעקב אחר עכברי ה-wild type ועכברי ה-knockout.
תאי תורמים לאחר השתלת מח עצם. השתמשו בעכברי CD 45.1 כדי לייצג עכברים מסוג פרא (wild type) וב-CD 45.2 עבור עכברי הknockout. התרשים המוצג כאן מתאר את מערך הניסוי; חמישה עכברי תורמים ועשרה עכברי מקבלים הוקצו לכל קבוצה.
עבור קבוצות A ו-B, תהיה השתלה של מוח עצם מעכברים מסוג הפרא (wild type) לעכברים עם נוק-אאוט (knockout). קוליטיס תהיה מושרית בקבוצה A, אך לא בקבוצה B. עבור קבוצות C ו-D, תהיה השתלה של מוח עצם מעכברי נוק-אאוט לעכברי wild type, וקוליטיס תהיה מושרית בקבוצה C בלבד. עבור קבוצות E ו-F, ההשתלה תהיה מ-wild type ל-wild type, ועבור קבוצות G ו-H, ההשתלה תהיה מנוק-אאוט לנוק-אאוט. כדי להכין את מוח העצם של התורם להעברה לעכברים שהוקרנו, התחל בהוצאת מוח עצם מהעצמות של עכברים שהוקרבו בתוך קבינה לבטיחות ביולוגית.
השתמשו בכלי ניתוח סטריליים כדי לחשוף את עצמות ההומרוס, הפמור, הטיביה והפיבולה, תוך ניקוי שרירים ורצועות הנצמדים אליהן, והעבירו אותן לצחנת פטרי. חתכו את שני קצות העצמות כדי לחשוף את מחית העצם האדומה. לאחר מכן, אחזו באחת העצמות בעזרת פינצטה.
שטפו את מחלק היתר האדום החוצה באמצעות PBS קר עם מזרק של שלושה מיליליטר ומחט במידה 25 gauge אל תוך צלחית פטרי אחרת. לאחר מכן, שטפו את העצם מהקצה השני כדי להפיק תאי מחלק יתר נוספים. חזרו על תהליך זה עם כל אחת מהעצמות.
אגדו את מחלקי הגזירה (bone marrow) של עכברים מסוג wild type ועכברי knock out בנפרד. השתמשו במזרק של 6 mL עם מחט במידה 18 gauge ובאורך חצי אינץ' כדי לפרק את גלילי מחלק הגזירה האדום באמצעות שאיבה והזרקה חוזרות. לאחר מכן, השתמשו בפיפטה סרולוגית להעברת מחלק הגזירה שנאסף למבחנה קונית של 50 mL.
לאחר העברת כל מחולל השלד, סובב את מחולל השלד בצנטריפוגה במהירות של 740 G למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסבוב, השלך את הנוזל העליון (supernatant) ושחזר את המשקע על ידי ערבוב ב-vortex למשך חמש עד 10 שניות. למשקע, הוסף חמישה מיליליטר של one XRBC lysis buffer עבור כל עכבר תורם, ערבב שוב ב-vortex למשך חמש שניות והדגר בדיוק למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר שלוש דקות, הוסיפו 20 milliliters של PBS קר לכל מבחנה וערבבו על ידי הפיכה כדי לעצור את הליסיס. לאחר מכן, שפכו את התוכן דרך מסננת תאים של 40 micron לתוך מבחנה קונית חדשה של 50 milliliters. שטפו את המבחנה המקורית עם חמישה milliliters של PBS והעבירו את התמיסה למסננת התאים.
המשך את איסוף התסנן (flow through) אל תוך הפיפטה הקונית. לאחר מכן, השלם את הנפח ל-50 milliliters באמצעות PBS וערבב על ידי היפוך. לאחר מכן, קבע את מספר התאים החיים בשיטת הדחת trypan blue באמצעות המוציטומטר (hemocytometer).
לאחר שספירת התאים נקבעה, סובבו את תאי מחול השחם ב-913 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C. לאחר הסבוב, הסירו את העלייה (supernatant) בהתאם לספירה הכוללת של התאים. השעיקו מחדש את המשקע ב-PBS בריכוז של 1 × 10⁸ תאים למילליטר.
תאי מחית העצם מוכנים כעת להעברה לעכברים רקפטורים שהוקרנו. העכברים מסוג הפרא (wild type) והעכברים עם נוק-אאוט (knockout) ששימשו רקפטורים בניסוי זה הוקרנו ב-1000 rad כפי שמתואר במסמך הנלווה; העכברים רבו ושוכנו במתקן נקי מפתוגנים. ארבע עד 24 שעות לאחר ההקרנה, חממו את העכברים הרקפטורים על פד חימום תחת מנורת חימום לפני הזרקת מחית העצם התורמת. מקמו עכבר רקפטור במכשיר קיבוע, ונגבו את הזנב ב-70% ethanol כדי לעקר את נקודת ההזרקה ולעודד התרחבות כלי דם מקומית להזרקה קלה.
באמצעות מזרק אינסולין עם מחט במידה 28.5, מזריקים 1×10⁷ תאים ב-1 עד 200 µL לווריד הזנב של כל עכבר לאחר ההזרקה. יש להניח את העכבר בכלוב עם עד שלושה עכברים מוזרקים נוספים במהלך ארבעת השבועות הראשונים לאחר ההזרקה. יש לתחזק את העכברים המקבלים שהוזרקו בכלובים שעברו עיקור באוטוקלב עם מים המכילים את האנטיביוטיקה sulfa trim.
שלב זה מאפשר לבעלי החיים להחזיר לעצמם את החסינות; יש להחליף את הכלובים, את המים המטופלים באנטיביוטיקה ואת המזון מדי ארבעה ימים לשמירה על ההיגיינה. ארבעה שבועות לאחר ההקרנה והשתלת מח עצם, יש לעבור למים רגילים ללא אנטיביוטיקה ולהחזיק את העכברים למשך שבועיים נוספים כדי להשיב את מיקרופלורת המעי הרגילה שלהם. שישה שבועות לאחר הזרקת מח העצם, יש למדוד את משקל הגוף ההתחלתי כדי להשרות קוליטיס.
העניקו לעכברים בקבוצת הניסוי של הקוליטיס (colitis) דקסטראן סולפט בריכוז 5% במי השתייה. לאחר חמישה ימים, אספו את הדם הפריפרי מארבעה עכברים לשפרויות vacutainer מצופות הפרין והניחו אותן על קרח. לאחר מכן, בתוך מבחנת מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר, ערבבו 300 מיקרוליטר של דם עם 300 מיקרוליטר של תמיפת סומן לצביעת תאים, וחלקו את הדם לחמישה מבחנות בדיקה לציטומטריה זורמת המסומנות אחת עד חמש, כך שבכל אחת יהיו 100 מיקרוליטר על קרח.
לאחר הקרבת העכברים, מדדו שוב את משקל הגוף וחשבו את השינוי. בצעו דיסקציה של רקמות המעי הגס והניחו אותן בפורמלין לצורך צביעות h ו-d. לאחר מכן, השגיחו תאי מחלץ גרם כפי שבוצע קודם לכן.
חלק את מחית מחול ה अस्थי (bone marrow) לחמשה מבחנות מיקרו-צנטריפוגה המסומנות כמספר אחת עד חמש, כאשר בכל אחת 100 milliliters. כהכנה לאנליזה באמצעות פלוו ציטומטריה (flow cytometry), הכן את תערובת הנוגדנים עבור כל מבחנה בהתאמה בחשיכה כפי שמתואר במסמך המצורף. דגימות דם ומחול עצם המסומנות כמספר אחת ישמשו כביקורות ולא ייצבעו. דגימות דם ומחול עצם המסומנות כמספר שתיים ייצבעו עם fitzy isotype control PE isotype control ותמיסת חסימה של CD 16/32.
בקרות איזוטיפ אלו משמשות לאישור הספציפיות של קישור הנוגדן הראשוני לדגימות. דגימה מספר שלוש תצבע עם FZ CD 45.1 ו-CD 16/32. דגימות תמיסת החסימה המסומנות כמספר ארבע יצבעו עם CD 45.2 ו-CD 16/32.
תמיסת חסימה. סימון בצבע בודד יכול לחשוף את נוכחותם של תאי תורם או מקבל בדם או במח भारतात. דגימות המסומנות במספר חמש ייצבעו עבור CD 45.1, CD 45.2 ו-CD 16/32.
סימון בצבע כפול כאן מראה את היחס היחסי של תאי תורם ותאי מקבל בדם או במחול השכימה. הוסיפו 5 µL של תערובת נוגדנים 2 ו-5 לפקעות הדגימה המתאימות להם. לאחר מכן, הוסיפו 3 µL של תערובת נוגדנים 3 ו-4 לפקעות הדגימה המתאימות להם.
דגרו את כל המבחנות על קרח למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, הוסיפו שני מיליליטרים של XRBC lysis buffer לכל מבחנה. לאחר מכן, דגרו את הדגימות למשך 15 דקות נוספות על קרח בחשיכה.
סבבו את התאים ב-350 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C. לאחר הסבב, הסירו את הנוזל העליון ושחזרו את המשקע עם 500 µL של בופר לצביעת תאים בחושך. לאחר מכן, בצעו ערבוב קצר במכשיר vortex.
בשלב הבא, בצעו ציטומטריה של זרימה (flow cytometry) על דגימות הדם ומח העצם שצבעו אימונוהיסטוכימית. בחרו ב-FZ כדי לייצג את ה-CD 45.1 מסוג הפרא (wild type) וב-PE כדי לייצג את ה-CD 45.2 של הנוק-אאוט (knockout). נתחו את תוצאות הציטומטריה של הזרימה באמצעות התוכנה של Flo Joe.
חשב את היחס בין fit E ליחס PE או בין PE ליחס fit e כדי לקבוע האם הגנוטיפ של התורם הוא הגנוטיפ הדומיננטי בדם ובמחולק הגרמיים. תמונה זו מציגה דוגמאות של תמונות h ו-e של מעיים הגדלים עם היסטולוגיה תקינה וקוליטיס DSS. תמונות היסטולוגיות מקבלות ציון על בסיס נזק לרקמת הרירית והסננה של נויטרופילים לרקמות הרירית והסוב-מוקוזה.
לפיכך, ציון היסטולוגי גבוה יותר מעיד על קוליטיס חמורה יותר, במטרה לבחון האם ל-lyin יש תפקיד במניעת קוליטיס. בוצע החלפת מחיתי עצם בין עכברים מסוג wild type לעכברים עם knockout כפי שמתואר בסרטון זה. לאחר מכן הוערכה ההיסטולוגיה וניתן לה ציון כפי שמוצג כאן.
ציוני ההיסטולוגיה עלו באופן משמעותי כאשר מחולל גרעין עצם של עכברי knockout הוחדר לעכברי wild type שהוקרנו. לעומת זאת, הציונים ירדו באופן משמעותי כאשר גרעין עצם של wild type הוחדר לעכברי knockout. נתונים אלו מעידים כי C אנדוגני מתאים לתאים המופקים מגרעין העצם בעל השפעות אנטי-דלקתיות ומשפר את הקוליטיס, כדי לאמת כי השתלה זו הצליחה בעכברים אלו.
בייהוצעו גם בדיקות ציטומטריית זרימה על מחולל השגים ודם מהעכברים לאחר השתלה. מחולל השגים של סוג בר (Wild type) נצבע באופן חזק עבור Fitz CD 45.1 אך לא עבור pe, CD 45.2 כפי שמוצג כאן; מחולל השגים של עכברי נטרף (knockout) נצבע באופן חזק עבור PE אך לא עבור Fitz כפי שמוצג כאן. עם זאת, לאחר ההשתלה, הן מחולל ההשגים והן הדם מעכברי סוג בר שקיבלו מחולל השגים של עכברי נטרף נצבעו באופן חזק עבור PE אך לא עבור Fitz, מה שמעיד על כך שהאוכלוסייה הדומיננטית של התאים הצבועים הייתה מהתורם.
באופן דומה, מחית עצם ודם מעכברים עם נוק-אאוט (knockout) שקיבלו מחית עצם מסוג בר (wild type) נצבעו בעוצמה עבור fitzy אך לא עבור pe, מה שמאשר שוב כי האוכלוסיות שצבעו היו בעיקר ממקור התורם. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם תהיו מסוגלים לבצע ניסוי של השתלת מחית עצם ולהיות מסוגלים לשנות קוליטיס באמצעות תאים המופקים ממחית עצם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את תפקידו של הפפטיד האנטי-מיקרוביאלי lyin בהפחתת קוליטיס המושרה על ידי dextran sulfate בעכברים באמצעות השתלת מחית עצם. באמצעות השתתלת מחית עצם מעכברי wild type ועכברי knockout, הניסוי מעריך את ההשפעה על חומרת הקוליטיס.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של השתלות
רקע
- השתלת מח עצם יכולה לשנות את הגנוטיפ של תאים המופקים ממח העצם.
- קוליטיס היא מודל לחקר מחלות מעי דלקתיות.
- פפטידים אנטימיקרוביאליים עשויים להשפיע באופן טיפולי על דלקת.
- ציטומטריית זרימה והיסטולוגיה הן טכניקות מפתח לצורך תיקוף והערכה.
מטרת המחקר
- לקביעה אם lyin יכול להקל על תסמיני קוליטיס.
- להערכת השפעות הגנוטיפ של מח עצם על חומרת הקוליטיס.
- לאימות הצלחת השתלת מח העצם.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הזרקת מחית גרמית מעכברים מסוג wild type ועכברים עם נוק-אאוט (knockout) לנRecipient-ים שהוקרנו.
- השראת קוליטיס באמצעות דקסטראן סולפיה לאחר ארבעה שבועות.
- תיקוף של הצלחת ההשתלה באמצעות ציטומטריה של זרימה.
- הערכת נזק לרקמת המעי הגס באמצעות אנליזה היסטולוגית.
תוצאות עיקריות
- סימפטומים של קוליטיס פחתו כאשר בוצעה השתלת מח עצם מסוג wild type לעכברים עם knockout.
- השתלת מח עצם מוצלחת אוששה באמצעות ציטומטריה של זרימה (flow cytometry).
- ניתוח היסטולוגי העיד על נזק מופחת לרקמת המעי הגס בעכברים המטופלים.
- המחקר תומך בתפקיד טיפולי פוטנציאלי של lyin בקוליטיס.
מסקנות
- השתלת מח עצם יכולה לשנות ביעילות את התגובה החיסונית בקוליטיס.
- Lyin עשוי להוות מועמד מבטיח להתערבות טיפולית במחלות מעי דלקתיות.
- נדרשים מחקרים נוספים כדי לבחון את המכניזמים העומדים בבסיס השפעות אלו.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
גישה זו מאפשרת למחקר ופיתוח בביופארמה לנתח תפקודי גנים ספציפיים לסוגי תאים במודלים של מחלות דלקתיות, ובכך לתמוך בתיקוף של מטרות טיפוליות על ידי בידוד התרומות של מדורי מערכת החיסון לעומת מדורים שאינם חיסוניים. באמצעות שימוש בהשתלת מחית עצם עם סמנים קונגניים, חוקרים יכולים להפחית סיכונים בהיפותזות מכניסטיות לפני השקעה בשיטות טיפוליות. השיטה מספקת ביטחון ניבוי בבחירת המטרה על ידי הבהרה אם גן מסוים מפעיל את השפעתו דרך מסלולים המטופואטיים או סטורמליים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזה טיפולית על ידי קביעה האם תפקידו של גן בקוליטיס נובע מתאים שמקורם במח העצם.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרה באמצעות החלפת גנוטיפ בין עכברים תורמים למקבלים.
- ערך מדעי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי הבהרת המקור התאי של ביטוי גנים בפנוטיפים של מחלה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- ערך מדעי: הכנת מערכות ביולוגיות עובריות עם גנוטיפים כימריים ידועים עבור בדיקות סקר חיסוניות או אפיתליאליות המשך.
- ערך תפעולי: הבטחת סטנדרטיזציה ושחזור של הבדיקה באמצעות מעקב אחר השתבשות התורם (engraftment) באמצעות ציטומטריה של זרימה עבור CD45.1/CD45.2.
- ערך מדעי: מאפשר הערכה מהימנה של תרכובות במודלים של קוליטיס שבהם תרומתם של תאי מערכת החיסון מבודלת.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על הרלוונטיות למחלה על ידי מידול קוליטיס במערכת שבה ניתן להפריד את ביטוי הגנים לתאים המטופויטיים או לתאים שאינם המטופויטיים.
- ערך תפעולי: תומך בהלימה של ביומרקרים טרנסלציונליים על ידי מתאם בין רמות כימריזם לבין מדדי היסטולוגיה של קוליטיס.
- ערך מדעי: מספק מידע לקבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים על ידי הבחנה האם מודולציה של המטרה דורשת מיקוד בתאי מערכת החיסון.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות לגבי מטרה ועד לתיקוף פרה-קליני, במיוחד כאשר נבחנים מנגנונים המתווכים על ידי מערכת החיסון.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובהבהרת מסלולים על ידי בידוד תפקוד הגן בתאים שמקורם במח העצם לעומת מדורי סטורמה.
- סריקה: מתאר את מוכנות הבדיקה באמצעות כימריזם מאושש והשראה רבזורית של קוליטיס באמצעות DSS.
- אנליטיקה: מדגיש תוצאי ציטומטריה זרימה כמותיים של יחסי CD45.1/CD45.2 למדידת השתרשות ולאפשר סטרטיפיקציה של קבוצות.
- מחקר תרגומי: מקשר בין הגילוי להמשכיות פרה-קלינית על ידי קישור אישוש הכימריזם לתוצאות היסטולוגיות בקוליטיס.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר לחקר כל גן רלוונטי במודלים של מחלות התלויות בתאי מערכת החיסון.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה באמצעות רזולוציה תאית של תפקוד גנים בדלקת.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה והדירות באמצעות מעקב אחר סמנים קונגניים ותיקוף באמצעות ציטומטריית זרימה.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) על ידי זיהוי השאלה האם מיקוד טיפולי צריך להתמקד בתאים חיסוניים או בתאים שאינם חיסוניים.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם סיכון המבוסס על בהירות מכניסטית של מנגנון הפעולה של המטרה.
שיקולי יישום
- מומחיות נדרשת באיסוף מחית גרמית, הקרנה והשתלת תאים המטופויטיים.
- ציוד לציטומטריית זרימה לגילוי כימריזם של CD45.1 ו-CD45.2 בדם ובמחית הגרמית.
- סטנדרטיזציה בין מעבדות עבור מינוני ההקרנה וספי זהות לתיקוף השתרשות (engraftment).
- שיקולי התאמה עבור רקעים גנטיים שונים מעבר ל-C57BL/6.
- מגבלה מעשית: השתרשות חלקית מחייבת מעקב אחר כימריזם כדי לאשר את התקינות הניסויית.
