בידוד, טיהור וסימון של נויטרופילים מח עצם עכבר ללימודים פונקציונליים וניסויי העברת מאמצת

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד ולתייג נויטרופילים ממח עצם עכבר למחקרים פונקציונליים במורד הזרם וניסויי העברה לאימוץ. זה מושג על ידי איסוף תאי מח העצם תחילה ממורין, עצם הירך והשוקה. במהלך השלב השני, תאי הדם האדומים מחוברים באופן אוסמוטי על ידי השעיה רציפה שלהם בתמיסות נתרן כלורי של 0.2% ו-1.6% בהתאמה.

לאחר מכן, הנויטרופילים מבודדים על ידי צנטריפוגה של שיפוע צפיפות. בשלב האחרון, הנויטרופילים מסומנים בצבעי מעקב תאים. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בזרימה ציטומטרית כדי לקבוע את מספר הנויטרופילים שהועברו באימוץ שגויסו לרקמות עכבר שונות.

היתרון העיקרי בבידוד נויטרופילים של עכברים ממח העצם על פני הדם או הצפק, הוא שניתן להשיג ממח העצם את מספר התאים הגדול המספיק למחקרים פונקציונליים במורד הזרם ולניסויי העברה מאמצים הן במצב יציב והן לאחר ההדבקה. היתרון בשימוש בטכניקת צנטריפוגה שיפוע לבידוד נויטרופילים של עכברים על פני ברירה מגנטית חיסונית של מיון תאים מופעל פלואורסצנטי הוא בכך שהיא חסכונית במהירות והיא נמנעת מתיוג הנויטרופילים בנוגדנים שעלולים לגרום להפעלת נויטרופילים. מי שמדגים את ההליך יהיה מוקה סוואמי אותנו, טכנאי מהמעבדה שלי לאחר שריסס עכבר שהורדם עם 70% אתנול.

בצע חתך באזור הבטן האמצעי של עור החיה ולאחר מכן הסר את רקמת העור מהחלק הדיסטלי של החיה, כולל הגפיים התחתונות. לאחר מכן, השתמש במספריים כדי לחתוך את השרירים מהגפיים האחוריות של החיה ולאחר מכן לעקור בזהירות את ה-ACE beum ממפרק הירך, הימנע משבירת ראש עצם הירך. לאחר מכן השתמש במספריים באזמל כדי להסיר את השריר שנותר מעצם הירך והשוקה.

הפרד את עצמות הרגליים במפרק הברך, הקפד לא לשבור את קצות העצם, ואז הניח את העצמות בצלחת פטרי המכילה RPMI קר כקרח 1 6 4 או. תוסף עם FBS ואנטיביוטיקה. העבירו את המנה למכסה המנוע של תרבית רקמות ולאחר מכן עקרו את החלק החיצוני של כל עצם עם 70% אתנול בצלחת פטרי חדשה.

לאחר כ-10 עד 15 שניות, יש לשטוף את האתנול מפני השטח של כל עצם בשלוש שטיפות עוקבות ב-PBS קר וסטרילי כקרח. לאחר מכן חותכים ומניחים את האפיפיזה מכל אחת מהעצמות לצלחת פטרי סטרילית חדשה. לאחר מכן, חבר מחט בגודל 25 למזרק 12 סמ"ק מלא ב-10 מיליליטר RPMI.

השלמה עם FBS ו-EDTA. לאחר מכן שטפו את תאי מח העצם משני קצוות הפיר של כל זוג עצם הירך על צינור פלקון עליון בורג של 50 מיליליטר דהוי עם מסנן של 100 מיקרומטר כדי להסיר את כל התאים. מגרדים את המשטחים הפנימיים של העצמות בעזרת קצה המחט.

כאשר העצמות נראות מולבנות, התאים הוסרו מספיק. כעת השתמש באזמל כדי לחתוך את אפיפיזות העצם לחתיכות Q קטנות של 0.5 עד מילימטר אחד, ולאחר מכן השתמש בקצה האחורי של קצה מסרק 2.5 מיליליטר בתוספת קצה פיפטה BioPure כדי לרסק אותן דרך מסנן 100 מיקרומטר. לאחר סיבוב התאים שנקטפו במשך שבע דקות ב-427 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס כדוריות הדם האדומות ב-20 מיליליטר של 0.2% נתרן כלורי למשך כ-20 שניות.

לאחר מכן עצור את הליזיס עם 20 מיליליטר של 1.6% נתרן כלורי, סובב את התאים ואז השהה מחדש את הגלולה בתוסף RPMI 1 6 4 oh עם FBS ו-EDTA. ספרו את התאים ולאחר מכן לאחר שסובבו אותם שוב, השעו מחדש את הכדור השטוף בלא יותר מ-100 פעמים 10 לששת התאים למיליליטר קרח. PBS סטרילי קר מוציא כעת שלושה מיליליטר של 18 עד 26 מעלות צלזיוס, האטום שלו 1 1 1 9 לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר, ואז מכסה לאט לאט שלושה מיליליטר של 18 עד 26 מעלות צלזיוס.

האטום שלו 1 0 7 7. הימנעות מערבוב שתי הצפיפויות מיד לאחר הכנת האטום שלו שכבה בזהירות של תרחיף תאי מח העצם על גבי הצנטריפוגה האטומה שלו 1 0 7 7, שיפוע הצפיפות למשך 30 דקות ב 834 פעמים G ו -25 מעלות צלזיוס ללא השבירה, ולאחר מכן לאסוף את הנויטרופילים בממשק של השכבות האטומות שלו 1 1 1 9 ו- 1 0 7 7. לאחר שטיפת הנויטרופילים שנאספו פעמיים ב-RPMI 1 6 4 oh FBS ואנטיביוטיקה Resus השעו את התאים בחמש פעמים 10 לששת התאים למיליליטר ב-PBS מחממים מראש ל-37 מעלות צלזיוס.

לאחר ספירת התאים, שמור כמות קטנה של כל דגימת ניסוי כדי לקבוע את הטוהר והכדאיות על ידי זרימה ציטומטרית ולאחר מכן סמן את הנויטרופילים הנותרים בצבע מעקב אחר תאים בריכוז סופי של חמישה מיקרומולר למשך 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס באמבט מים רועדים בחושך. לבסוף, שטפו את התאים פעמיים עם תוסף RPMI 1 6 4 oh קר כקרח עם FBS ואנטיביוטיקה כדי למנוע זיהום צולב של צבע לפני ערבוב אוכלוסיות הנויטרופילים המסומנות באופן דיפרנציאלי למחקרי אוכלוסייה תחרותיים במורד הזרם כאן, עלילות ציטומטריית זרימה מייצגות של שיפוע צפיפות מבודד מח עצם מופרדים נויטרופילים מעכבר C 57 שחור שש לא נגוע מוצגות בפאנל זה. השער הראשוני המשמש לתאי מח העצם שנאסף מהממשק של היסטופת 1 1 1 9 והיסטופת 1 0 7 7.

באמצעות פיזור קדימה וצדדי מודגם, הנויטרופילים המופרדים בשיפוע הצפיפות גדולים מ-90% טהורים וגדולים מ-95% ברי קיימא לפחות ארבע שעות לאחר מעקב אחר תאי העברה מאמצים. ניתן לעקוב אחר נויטרופילים של תווית DIA על ידי זרימה ציטומטרית בבעיות עכברים שונות. לדוגמה, בדם, במח העצם ובכליות של המקבל נגוע בקנדידה C 57 שחור שישה עכברים שהוצגו בניסוי זה על ידי שער על תאי CD 45 LY 6 G CD 11 B חיים, ניתן להבדיל בין נויטרופילים מייצגים אלה המועברים באימוץ C-M-T-M-R לבין הנויטרופילים השליליים המקוריים C-M-T-M-R ו-PE של העכבר המקבל על ידי ביטוי ה-PE שלהם.

לאחר השליטה, ניתן להשלים את הבידוד והתיוג של נויטרופילים של מח העצם של העכבר תוך שלוש שעות.