מדידה של אפקטי נוגדנים על תפקוד תאי של cardiomyocytes המבודד
8 במרץ 2013
השיטה הוצגה מציעה דרך לזהות נוגדנים עצמיים cardiotropic יעילים פונקציונליים בפלזמה של חולים עם קרדיומיופתיה המורחבת, ללא קשר לאנטיגן הספציפי, על ידי ניתוח ההשפעה של אימונוגלובולין חולה המבודד בקיצור הסלולר וארעי סידן תאי בcardiomyocytes חולדה המבודדת.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לזהות נוגדנים קרדיוטרופיים בפלזמה של חולים עם קרדיומיופתיה מורחבת או מחלות לב אחרות בעלות רקע אוטואימוני. דבר זה מושג באמצעות מיני-ספיחה חיסונית ראשונית של פלזמה מהחולה בעמודי ספרוס (spheros) אנטי IgG לניקוי של אימונוגלובולין G כשלב שני. קרדיומיוציטים ונטריקולריים מבודלים מחולדות Wistar בוגרות, המספקות את הבסיס התאי לבדיקה הביולוגית זו.
בשלב הבא, מאפשרים לתאי השריר הלבבי (cardiomyocytes) להיצמד לזכוכית הכיסוי של התא וצובעים אותם ב-URA 2:00 AM כדי לאפשר תצפית על תנודות סידן תוך-תאיות במהלך התכווצויות, ולאחר מכן בוחנים את ה-IgG של המטופל כדי לבחון את השפעתו על כושר התכווצות התאים. התוצאות מדגימות האם ה-IgG של המטופל מכיל נוגדנים טרופיים בהתבסס על השינויים בכושר התכווצות ובתנודות הסידן בתאי השריר הלבבי המבודדים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקות אימונו-ספציפיות סטנדרטיות לזיהוי נוגדנים, הוא שהיא אינה תלויה באנטיגן ספציפי ושהיא מאפשרת להבחין בין נוגדנים מעוררים לנוגדנים חוסמים.
הדגמת הפרוצדורה תתבצע על ידי Google ובסיוע טכני מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, הכינו את עמודי הספיחה החסונית המינימליים על ידי מילוי של 3 mL של כדוריות anti IgG עבור כל 2 mL של פלזמת EDTA של המטופל לתוך עמוד econopak ריק. לאחר מכן, הניחו מסנן מעל כדוריות ה-anti IgG.
גזרו את הקצה התחתון של העמודה ולחצו על המסנן כדי להגיע לקצב זרימה של בערך טיפה אחת לשנייה. לאחר מכן, שטפו את העמודה שלוש פעמים עם נפח פלזמה אחד של 0.9% Sodium chloride. העבירו בפיפטה את הפלזמה אל העמודה; כאשר הפלזמה הוטבעה לחלוטין ב-anti IgG Spheros, שטפו עם אותו נפח של 0.9% sodium chloride. לאחר מכן, העבירו בפיפטה נפח פלזמה אחד של 0.2 molar glycine hydrochloride ב-pH 2.8 אל העמודה והניחו לו להיספג פנימה.
לאחר מכן, הוסיפו לנפח נוסף של glycine hydrochloride לעמודה. אספו את הזרימה לשפרו של 15 מיליליטר וכווןו את ה-pH ל-7.3 באמצעות 0.5 molar tris hydrochloride ב-pH 8.0 כדי להגביש מחדש את העמודה. שטפו אותה בשלושה נפחי פלסמה של glycine hydrochloride לאחר שטיפה סופית של שני נפחים של 0.9% sodium chloride.
ניתן להשתמש בעמודה עבור דגימת הפלסמה הבאה לשימוש בתאי שריר לב (cardiomyocytes). יש לדייאלзировать את פראקציית ה-IgG שנאספה כנגד בופר ניסויי, תחילה על ידי מילוי פראקציית ה-IgG לתוך צינור ממברנת דיאליזה של cellulose ester עם סף משקל מולקולרי של 100 kilodaltons. לאחר מכן, יש להניח את הצינור בתוך ליטר אחד של EB ולערבב לאט באמצעות בוחש מגנטי בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס. לאחר שמונה שעות, יש להעביר את צינור הדיאליזה לשלושה ליטרים של EB טרי ולדייאלзировать למשך 20 שעות נוספות בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס לאחר הדיאליזה.
הרתח את הדגימה למשך 30 דקות ב-57 °C באמבט מים. כדי לבטל את פעילות גורמי המשלים, קבע את ריכוז ה-IgG הכולל והכן אליקוויטות שכל אחת מהן מכילה 330 µg IgG. בהליך זה, הכן באפר בידוד נטול סידן בהתאם לכתב היד המצורף.
לאחר מכן, מלאו 80 milliliters של IB במאגר העליון של מערכת פרפוזיה תרמוסטטית מסוג lanor, שמרו על התמיכה בטמפרטורה של 37 °C ואווררו אותה עם 95% oxygen ו-5% carbon dioxide למשך 30 דקות. המיסו כ-7,000 עד 10,000 יחידות של collagenase type two ו-174 milligrams של BSA נטול חומצות שומן ב-20 milliliters של IB המכילים 112.5 µM של calcium chloride, ובמידת הצורך, כווןו את ה-pH של באפר הבידוד במאגר העליון.
בשלב הבא, הרדימו חולדת Wistar במשקל 175 עד 200 גרם באמצעות thiopental במינון של 375 micrograms לקילוגרם, כאשר תמיסת ה-thiopental כוללת תוספת של 2,500 IU heparin. לאחר פתיחת בית החזה (thoracotomy), הוציאו בזהירות את הלב עם קשת האורטה (aortic arch) שלמה והעבירו אותו לתמיסת sodium chloride בריכוז zero point percent קרה מאוד בתוך קרח. הסירו את הדם ואת הרקמות הסובבות מהלב.
לאחר מכן, העבירו אותו ל-0.9% sodium chloride טרי וחשפו את האורטה. הפעילו את מפחית הזרימה של מערכת ה-langor כדי להשיג מהירות טיפות של שתיים עד שלוש לשנייה. לאחר מכן, חברו את הלב לקנולה.
בצעו פרפוזיה למשך עד שלוש דקות בקצב זרימה של טיפה אחת לשנייה כדי לשטוף את הדם שנותר. לאחר מכן, הזרים את ה-IB במערכת ה-LOR. כעת הוצאו 20 milliliters של באפר מהמאגר העליון.
מלאו את המאגר בתמיסת הקולגנאז (collagenase) והוסיפו בופר בכמות הדרושה כדי להגיע ל-80 milliliters. לאחר מכן, הזרים את תמיסת העיכול למשך 27 דקות נוספות. לבסוף, נתקו את הלב מהקנולה.
הסיר את העליות ואת אבי העורקים, ולאחר מכן קצץ את החדרים לחתיכות קטנות. אפשר לתמיפת העיכול לזרום למאגר התחתון. הפחת את הנפח למקסימום של 40 milliliters כדי להמשיך בעיכול של החדרים הקצוצים למשך 10 עד 15 דקות תחת אוורור רציף של 95%oxygen ו-5%carbon dioxide.
לאחר מכן, סננו את תרחיף התאים דרך גזה בעלת גודל רשת של 200 micron לתוך מבחנה של 50 milliliter. לבסוף, השביחו את תכולת הסידן של התאים על ידי צנטריפוגציה של תרחיף התאים במהירות של 40 3G למשך שתי דקות. בטמפרטורת החדר, השעיקו מחדש את התאים ב-10 milliliters.
סובב במערך צנטריפוגה שוב את ה-IB המכיל 200 micromolar calcium chloride וסספנד מחדש את התאים ב-10 milliliters של IB עם 500 micromolar calcium chloride. לאחר צנטריפוגה סופית, סספנד את תאי ה-cardiomyocytes ב-EB מסונן וסטרילי לצפיפות של 50,000 cells per milliliter.
צפו את זכוכית הכיסוי בתא בעל ארבעה בארות ב-10 micrograms למינין לבארה, והמתינו עד לייבוש מלא. לאחר מכן, מלאו מילליטר אחד של תרחיף קרדיומיוציטים בכל בארה. בעזרת מיקרו-פיפטה עם קצה קטוע, אפשרו לתאים להיקשר למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. דללו 10 microliters של תמיסת סטוק של fira 2:00 AM בריכוז של מילליטר אחד לכל מילליטר בחמישה מילליטרים של eb, ושמרו את תמיסת הצביעה בחושך.
בשלב הבא, הסירו את הבאפר ואת התאים שלא נצמדו מלוחיות הכיסוי והוסיפו באמצעות פיפט 0.5 milliliters של תמיסת הצביעה. הדגרימו את התאים בכל באר למשך 10 דקות תחת ניעור מתון. לאחר מכן, הסירו את תמיסת הצביעה ושטפו את התאים פעם אחת עם 1 milliliter eb.
לאחר מכן, הוסיפו 0.5 milliliters של EB לכל באר בהליך זה, והניחו את זכוכית הכיסוי תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך המחובר למערכת להקלטת סידן וכיוציות של מיוציטים. מקמו אלקטרודה בהתאמה אישית עם צינור כניסה וצינור יציאה בבארה הראשונה ושטפו את התאי הלבביים (cardiomyocytes) בעזרת EB בקצב של one milliliter לדקה.
התחילו את הגירוי החשמלי ב-20 volts, בתדר של one hertz ובמשך five milliseconds לכל פולס, ואפשרו לתאים להסתגל לגירוי למשך כשתי דקות. בחרו קרדיומיוציט שלם בצורת מוט עם פסיים ברורים והתכווצות קבועה, ומקמו אותו במרכז שדה הראייה. לאחר מכן, פתחו את ערוץ המצלמה והכווינו את התא באופן אופקי בתוך אזור הווידאו על ידי סיבוב מתאם מסגור התא והזזתבב המיקרוסקופ.
כווננו את גבולות אלמנטי הבקרה של אזור הגילוי בווידאו. הפעילו את הערוץ הפלואורסצנטי והקליטו 10 עד 15 התכווצויות כדי לקבל את קיצור התא הראשוני ואת הטרנזיאנט של הסידן. לאחר מכן, כבו את ערוץ התאורה של המיקרוסקופ כדי למנוע הבהרה (bleaching) של הצבע הפלואורסצנטי.
העבירו את הזרימה מ-EB למעקף הדגימה באמצעות שסתום תלת-כיווני והספיקו את התאי השריר הלבבי (cardiomyocytes) עם 1 mL של IgG של המטופל. עצרו את המשאבה רגע לפני שהאוויר מגיע לבאר, הדליקו את ערוץ האור והקליטו 10 עד 15 התכווצויות נוספות כדי לקבל את התגובה התאית החריפה. לאחר מכן, הפסיקו את ההקלטה וכבו שוב את ערוץ האור, חזרו על ההקלטות לאחר שתי וחמש דקות והוציאו את האלקטרודה מהבאר עם סיומן. לבסוף, נתחו את קיצור התא ואת הטרנזיאנט של הסידן באמצעות תוכנת ה-ion wizard, תוך שימוש בחלון edge length/length ובחלון URA two numeric subtracted/ratio בהתאמה.
בשלב הבא, חשבו את אחוזי השינוי עבור התגובות האקוטיות, התגובות לאחר שתי דקות והתגובות לאחר חמש דקות, ביחס לקיצור התא הראשוני ולגובה שיא הטרנזיאנט של הסידן. להלן דוגמה מייצגת של מדידת ביקורת. קיצור התא והטרנזיאנט של הסידן נוטרו באופן מקוון לפני הסופוזיה (superfusion) עם IgG, ומיד לאחר מכן, שתי דקות וחמש דקות לאחר הסופוזיה עם IgG.
וכאן דוגמה למדידה של דגימת IgG המכילה נוגדנים המדכאים את פעילות הלב. קיצור התא והמעבר של הסידן נמדדו באופן מקוון לפני הסופרופוזיה (superfusion) עם IgG, ומיד לאחר מכן, שתי דקות וחמש דקות אחרי הסופרופוזיה עם IgG. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן זיהוי נוגדנים המדכאים את פעילות הלב בפלזמה של מטופלים, על ידי מדידת השפעת IgG מבודד על קיצור תאים ובמעבר סידן של קרדיומיוציטים בוגרים מבודדים של חולדה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה לזיהוי נוגדנים עצמיים קרדיוטרופיים אפקטיביים ופונקציונליים בחולים עם קרדיומיופתיה מורחבת. הטכניקה מנתחת את השפעתו של אימונוגלובולין מבודד מהמטופל על התקצרות תאית ועל תנודות סידן תוך-תאיים בקרדיומיוציטים מבודדים של חולדה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- קרדיולוגיה
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- קרדיומיופתיה מורחבת קשורה לתגובות אוטואימוניות.
- גילוי נוגדנים קרדיוטרופיים הוא חיוני להבנת מחלות לב.
- שיטות קיימות מסתמכות לרוב על אנטיגנים ספציפיים.
- קיים צורך בטכניקות המסוגלות להבחין בין נוגדנים מעוררים לנוגדנים חוסמים.
מטרת המחקר
- לזיהוי נוגדנים קרדיוטרופיים בפלזמה של מטופלים.
- להערכת ההשפעות של IgG של המטופל על התכווצות תאי שריר הלב (cardiomyocytes).
- לספק שיטה שאינה תלויה באנטיגנים ספציפיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מיני-אימונו-אבסורפציה של פלזמה מחולית על עמודי spheros נגד IgG.
- בידוד של קרדיומיוציטים ונטריקולריים מחולדות Wistar בוגרות.
- צביעה של קרדיומיוציטים לצפייה בתנודות סידן תוך-תאיות.
- הערכת ההשפעה של IgG מהחולה על כושר הכיווץ של הקרדיומיוציטים.
תוצאות עיקריות
- שינויים ביכולת הכיווץ ובטרנסיאנטים של סידן מעידים על נוכחותם של נוגדנים טרופיים.
- השיטה מבדילה בהצלחה בין סוגים שונים של נוגדנים.
- התוצאות מדגימות את יעילות הטכניקה בהשוואה לבדיקות אימונו-סבסטיות סטנדרטיות.
- הממצאים תורמים להבנת המנגנונים האוטו-אימוניים במחלות לב.
מסקנות
- השיטה המוצגת היא גישה מהימנה לזיהוי נוגדנים קרדיוטרופיים.
- היא משפרת את היכולת לחקור תגובות אוטואימוניות בקרדיומיופתיה מורחבת.
- טכניקה זו עשויה לשפר את יכולות האבחון בקרדיולוגיה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת למחקר ופיתוח בביופארמה לזהות נוגדנים קרדיוטרופיים פעילים תפקודית בפלזמה של חולים ללא צורך בזיהוי מוקדם של האנטיגן, ובכך היא נותנת מענה לפער מרכזי במחקר של מחלות לב אוטואימוניות. באמצעות מדידת ההשפעות על התכווצות קרדיומיוציטים ועל מעברים של סידן, היא מספקת קריאה תפקודית המבדילה בין נוגדנים אוטואנטיגניים מעוררים לאלו החוסמים, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים של מטרות בשלבי גילוי מוקדמים. הגישה שאינה תלויה באנטיגן מגבירה את הביטחון החזוי לאסטרטגיות של התערבות טיפולית בקרדיומיופתיה מורחבת ובהתוויות קשורות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות באמצעות זיהוי נוגדנים עצמיים המודולטים באופן ישיר את תפקוד התאיים השריריים של הלב (cardiomyocytes).
- ערך תפעולי: מספק מערכת בדיקה תפקודית שאינה תלויה באנטיגנים ידועים, ובכך מרחיב את מרחב המטרות עבור קרדיולוגיה אוטו-אימונית.
- ערך ניבוי: מבדיל בין השפעות של נוגדנים מעוררים לנוגדנים חוסמים, ובכך משפר את רמת הביטחון בבחירת מטרות המבוססת על מנגנון פעולה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצרת קריאות כמותיות בזמן אמת של התקצרות תאים וטרנזיאנטים של סידן לצורך סריקת תרכובות או נוגדנים.
- שחזוריות: פרוטוקולים סטנדרטיים של בידוד וצביעה תומכים בתגובות תאיות עקביות בין ניסויים שונים.
- תועלת הפלטפורמה: מבססת ביו-אסיי (bioassay) רב-פעמי להערכת מועמדים לאימונומודולציה במודלים של מחלות קרדיווסקולריות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: שימוש בתאי שריר לב (cardiomyocytes) של חולדה בוגרת בעלי הומולוגיה גבוהה לחלבוני לב אנושיים, דבר המשפר את הפוטנציאל התרגומי.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: קשירת נוכחות נוגדנים עצמיים לתוצאות תאיות תפקודיות, התומכת בהסקה סיבתית במודלים של מחלות.
- המשכיות פרה-קלינית: מאפשר הערכה לאורכית של השפעת נוגדנים על כושר התכווצות וטיפול בסידן במערכת הרלוונטית למחלה.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי מולקולת מובילה (lead), ומספקת תובנות אימונולוגיות פונקציונליות המכוונות את בחירת המועמדים הפרה-קליניים במחקר של מחלות אוטואימוניות קרדיו-וסקולריות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על ידי קישור של IgG מהחולה לשינויים מדידים בפיזיולוגיה של קרדיומיוציטים.
- סריקה: מספקת מדידות כמותיות בזמן אמת של התכווצות וזרימת סידן להערכת השפעות אימונומודולטוריות.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה סטטיסטית של תגובות חריפות ותלויות-זמן לסופרפוזיה של IgG, ובכך תומכת באפיון קינטי ובקשר בין מינון לתגובה.
- מחקר טרנסלציונלי: עושה שימוש במערכת תאית רלוונטית למחלה עם הומולוגיה של אנטיגנים בין מינים, מה שמקל על אקסטרפולציה לפתופיזיולוגיה אנושית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה סטנדרטית לסריקת תרכובות אימונומודולטוריות או תכשירים ביולוגיים בהקשרים של מחלות אוטואימוניות קרדיווסקולריות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק תובנה מכניסטית לגבי תפקוד לקוי של קרדיומיוציטים המתווך על ידי נוגדנים עצמיים, ובכך מפחית עמימות בתיקוף המטרה.
- ערך תפעולי: מספק מדדי תפקוד סטנדרטיים וניתנים לשחזור הממזערים את השונות במבחנים בין מעבדות שונות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) על ידי זיהוי מוקדם של נוגדנים עצמיים פעילים תפקודית, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים של תוכניות לבביות-כליות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות מבוסס רמת סיכון, בהסתמך על השפעות תפקודיות המתווכות על ידי נוגדנים במערכת הרלוונטית למחלה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בבידוד קרדיומיוציטים, בדימות סידן ובמערכות לניטור כיווצות.
- תלוי בציוד פרפוזיה מסוג Langendorff, במיקרוסקופיה פלואורסצנטית ובתוכנה לניתוח המבוססת על ion/wizard.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית עבור טהרת IgG, הכנת תאים ופרוטוקולי גרייה.
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש תיקוף של הומולוגיה של אנטיגנים ותגובתיות תאית.
- מגבלות מעשיות כוללות גישה לרקמות, חלונות חיוניות של תאים והצורך בתשתית ייעודית לפרפוזיה ולדימות.
