תפוקה גבוהה ELISA סדרתית עבור אימות של סמנים ביולוגיים של מחלות אקוטיות שתל נגד מארח

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשתמש בבדיקות ELISA סדרתיות בעלת תפוקה גבוהה כדי לנתח ביעילות מספרים גדולים של סמנים ביולוגיים חדשים שהתגלו באמצעות פרוטאומיקה. דבר זה מושג תחילה על ידי הוספת דגימות ללוחית מקור, המשמשת ליצירת דילול עבור כל סמן ביולוגי ולאחסון פלזמה שהופקה בין הבדיקות. לאחר מכן, מבוצעות בדיקות ELISA עבור כל חלבון על מנת לקבוע את ריכוזיהם בדגימות של מטופלים.

בסופו של דבר, ניתן להעריך את העלייה ברמות החלבון של סמנים ביולוגיים אלו עם הופעתם של ביטויים קליניים של מחלת השתל נגד המארח חריפה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שמנתחים רצפיים יכולים לנתח חלבונים חדשים מרובים שאינם זמינים תמיד בפלטפורמות של multiplexing יתר. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על אבחון של מחלת השתל נגד המארח חריפה.

מאחר שביו-סמנים שתוּקפו באמצעות שיטה זו נחקרים כעת לצורך טיפול קליני, ועל אף ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי סיבוכים לאחר השתלת תאי גזע פואטיים פוסט-טראומטיים, ניתן ליישמה גם לגילוי ותיקוף של ביו-סמנים למחלות אחרות, כגון סיבוכים בהשתלות ריאה, סרטן הריאה, או פוטנציאלית לכל מחלה שבה בדיקת דם אבחנתית תהיה מועילה.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן חשוב לבצע את השלבים המרובים בעקביות כדי להבטיח שחזור ושונות נמוכה בין סדרות. ביום שלפני הניסוי, סביבו את דגימות מנות הפלזמה במשך 10 דקות ב-15,300 RCF ובטמפרטורה של 4°C כדי להפריד את הקרישים בתחתית ואת הליפידים בחלק העליון מהפלזמה. לאחר מכן, העבר 150 µL של פלזמה לא מדוללת מכל דגימה לתוך פלטת 96 בארות עם תחתית V באמצעות פיפוט ידני בהתאם למפות שהוגדרו מראש. עטוף את הפלטה ב-Parafilm והנח אותה בתא קירור ב-4°C למשך עד 72 שעות.

בשלב הבא, לאחר השחזור והדילול של הנוגדנים ללכידת IL two receptor alpha ו-human growth factor (או HGF) בהתאם למפרטי היצרן, העבירו מנות של 50 µL מכל נוגדן לכל באער של לוחות high binding half well בעלי 96 באערים בהתאמה. לאחר מכן, אטמו את הלוחות בעזרת סוגר לוחות והדגירו אותם לדגירה למשך הלילה בטמפרטורה של 4 °C. כעת, דללו את reg three alpha בעזרת תמיסת הציפוי (coating buffer) של היצרן על פי הפרוטוקול של היצרן, והעבירו 25 µL מהתמיסה לכל באער של לוח no maxor בעל 384 באערים.

לאחר מכן, אחסן את הפלטה הזו כשהיא אטומה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס גם כן ביום הראשון של הניסוי. התחל בשטיפת פלטת הבדיקה של IL two receptor alpha וחסימתה באמצעות blotto ב-TBS. לאחר שחזור הסטנדרט, הגדר עקום סטנדרט בעל שמונה נקודות בהתאם לפרוטוקול היצרן.

בפלטה הבאה, העבירו 50 µL של פלזמה לא מדוללת ו-50 µL של כל סטנדרט בשכפולים מהפלטה המקורית לפלטת בדיקת ה-ELIZA. לאחר מכן, הדגירו את הפלטה האטומה בטמפרטורת החדר על מסובב פלטות המכוון ל-300 RPM. לאחר שעתיים, העבירו את הפלזמה מפלטת בדיקת ה-ELIZA של IL two receptor alpha חזרה לפלטת המקור של הפלזמה לא המדוללת.

לאחר השלמת ה-EIA לפי פרוטוקול היצרן, קראו את הצפיפות האופטית של כל באר באמצעות קורא פלטות המכוון ל-450 עד 570 ננומטר. עבור ה-rich three alpha Eliza, העבירו תחילה 10 µL של פלזמה לא מדוללת לפלטת מקור נפרדת עם תחתית בצורת V, ולאחר מכן הוסיפו 90 µL של באפר דילול המסופק על ידי היצרן לכל באר כדי ליצור פלטת מקור בדילול של 1 ל-10. לאחר השלמת ה-Reg three alpha Eliza, בהתאם לפרוטוקול היצרן, הוסיפו את תמיסת העצירה (stop solution) לפלטת ה-384 בארות וקראו את הצפיפות האופטית של כל באר באמצעות קורא פלטות המכוון ל-450 עד 620 ננומטר. לאחר שחזור ודילול של הנוגדנים ללכידה (capture antibodies) של elephant ו-tn FFR one לפי מפרטי היצרן, ציפו כל באר בפלטות ה-96 בארות בעלות הקישוריות הגבוהה (high binding half well plates) הרלוונטיות עם 50 µL של הנוגדנים ללכידה.

לאחר מכן, דגרו את פלטות הבדיקה האטומות למשך לילה בטמפרטורת החדר עבור פלטת ה-elephant ובטמפרטורה של 4°C עבור פלטת ה-TN FFR one. עם השלמת ה-ELISA עבור IL-2 receptor alpha, העבירו 60 µL של פלזמה לא דלולה לפלטת מקור חדשה. לאחר מכן, הוסיפו 60 µL של 1% BSA ב-PBS לכל באר כדי ליצור פלטת מקור של פלזמה בדילול של 1:2.

בשלב הבא, שטפו וחסמו את לוחית הבדיקה של HGF באמצעות BLOTTO ב-TBS, ולאחר מכן הכינו דילול לעקומה סטנדרטית של שמונה נקודות. לאחר שטיפת הלוחית ובסיום שלב החסימה, העבירו ללוחית הבדיקה של EISA מנות כפולות של 50 µL של פלזמה מדוללת ביחס של אחת לשתיים ושל כל סטנדרט. לאחר מכן, הדגירו את הלוחית האטומה למשך הלילה בטמפרטורת החדר על מסובב לוחות המכוון ל-300 RPM.

למחרת בבוקר, העבירו את הפלזמה המדוללת ביחס של 1:2 מלוחית בדיקת ה-HGF ELISA בחזרה ללוחית מקור הפלזמה המדוללת ביחס של 1:2. לאחר השלמת ה-EIA, בהתאם לפרוטוקול היצרן, קראו את הצפיפות האופטית של כל באר באמצעות קורא לוחות המכוון ל-450 עד 570 ננומטר ביומה השני של הניסוי. ראשית, העבירו 10 µL של פלזמה לא מדוללת ללוחית מקור חדשה, ולאחר מכן 190 µL של 1%BSA ב-PBS כדי להכין 200 µL של פלזמה המדוללת ביחס של 1:20.

לאחר מכן, עם השלמת ה-ELISA בהתאם לפרוטוקול היצרן, מדדה אליזה את הצפיפות האופטית באמצעות קורא פלטות המכוון ל-450 עד 570 ננומטר. עבור ה-TN FFR, הוסיפה אליזה תחילה 25 מיקרוליטר של 1%BSA ו-PBS לפלטת המקור של דילול 1:20, מה שהביא ל-125 מיקרוליטר של פלזמה בדילול 1:25 לכל באר. לאחר השלמת ה-TN FFR EIA לפי פרוטוקול היצרן, מדדה את הצפיפות האופטית של כל באר באמצעות קורא פלטות המכוון ל-450 עד 570 ננומטר. עבור ה-IL-8 EIA, העבירה תחילה 60 מיקרוליטר של פלזמה בדילול 1:2 לפלטת מקור חדשה, ולאחר מכן הוסיפה 180 מיקרוליטר של מדלל IL-8 לכל באר כדי ליצור פלטת מקור של פלזמה בדילול 1:6.

לאחר השלמת ה-ILH Eliza בהתאם לפרוטוקול היצרן, קראו את הצפיפות האופטית של כל באר באמצעות קורא לוחות המכוון ל-450 עד 570 nanometers. לבסוף, ברגע שכל ה-Eliza הושלמו, החזירו את פלזמת ה-talk שאינה בשימוש לתוך ה-thought Eloqua והקפיאו לשימוש עתידי. בגרף זה, מוצגות הצפיפויות האופטיות עבור עקומת הסטנדרט של שבעה לוחות ELIZA שונים המודדים את ריכוזי reg three alpha התואמים ל-1084 המטופלים שנבדקו עבור הדיווח הראשוני על סמן ביולוגי של מחלת השתלת גרפט נגד מאכסן במערכת העיכול עבור reg three alpha; צפיפויות אופטיות עקביות בין הלוחות מבטיחות מדידות ריכוז חלבון עקביות בין ניסויים.

ריכוזי החלבונים בדגימות הפלזמה חושבו באמצעות השוואה בין הצפיפויות האופטיות של הדגימות לבין הצפיפויות האופטיות של עקומת הסטנדרט. ניתן להשתמש בפלטפורמת טיפול רובוטית נקייה כדי להגביר עוד יותר את השחזור, ובמקביל להפחית את נפח הפלזמה המשמש על ידי הרצת לוחיות בארות עבור Eliza וצורות יצירתיות. בעת תכנון הליך זה, חשוב להריץ תחילה EISs של פלזמה לא מדוללת, כדי שניתן יהיה להשיבה ולהשתמש בה בניסויים מאוחרים יותר לאחר פיתוחה.

טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הפרוטאומיקה לחקור סממנים ביולוגיים פוטנציאליים בכל מחלה רלוונטית באמצעות שימוש אוניברסלי בבדיקות ELISA סדרתיות. לאחר צפייה בסרטון זה, תשיגו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לתקף מספר סממנים ביולוגיים באמצעות ELISA סדרתי, תוך שימוש בנפחים קטנים של פלזמה וצמצום מחזורים חופשיים.