שתי והדמית תא חייה תלת ממדית של חלבוני תגובת ניזק לדנ"א
28 בספטמבר 2012
פרוטוקול זה מתאר שיטה להמחשת DNA חלבון איתות הפסקה כפולת גדיל הופעל בתגובה לניזק לדנ"א, כמו גם הלוקליזציה שלה במהלך מיטוזה.
הדגמה זו משתמשת בדימוי תאים חיים בדו-ממד (2D) ובתלת-ממד (3D) כדי להבין את הקשרים המרחביים והזמניים של חלבונים המעורבים בתגובה לנזקי DNA. ראשית, בצע טרנספקציה או טרנסדוקציה לקו התאים הנבחר באמצעות קונסטרוקטים של ביטוי המכילים סממנים פלואורסצנטיים מתאימים; במקרה זה M Cherry ו-GFP. לאחר מכן, רכוש סדרה של סרטוני ביקורת המראים את התאים המסומנים פלואורסצנטית בתנאים נורמליים.
לאחר מכן, יש להחיל טיפול מתאים וללכוד נתונים על השפעות הטיפול בתהליך התאים הפלואורסצנטיים, ולנתח את נתוני הווידאו עבור מערכות יחסים מרחביות-זמניות של חלבונים. בסופו של דבר, מיקרוסקופיית פלואורסצנציה של תאים חיים יכולה לפרט דינמיקה תאית, כגון היווצרות מוקדי 53 BP one בתגובה לחומרים הגורמים לנזק ל-DNA או את התנהגותו של 53 BP one במהלך המיטוזה. התעניינו לראשונה בדימות תאים חיים בדו-ממד ובתלת-ממד כאשר רצינו לבחון כיצד טיפולים שונים השפיעו על המיטוזה בקווי תאים מסוימים.
גישה ניסיונית זו מאפשרת לנו לחקור את התגובה לנזקי DNA ואת השמירה על היציבות הגנומית בקלות רבה יותר מאשר בשיטות מסורתיות. בנוסף, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחקור כיצד חלבונים מסוימים מקיימים אינטראקציה במסלולי איתות שונים ובקווי תאים שונים. היתרון המרכזי של דימות חי (live-cell imaging) על פני טכניקות מסורתיות, כגון ציטוכימיה, הוא היכולת לחקור את החלבונים המגיבים לנזקי DNA בזמן אמת.
אופטימיזציה של תנאי ההקלטה הנכונים עלולה להיות מאתגרת. ניתן להשתמש בהדגמה זו כדי לראות את השלבים הקטנים הרבים הדרושים להבטחת ההצלחה. זכרו שהתמדה משתלמת כשמדובר בצמצום פוטובליצ'ינג (photo bleaching), מציאת מרווחי ההקלטה הנכונים ואורך זמן ההקלטה המתאים, וכן הלאה.
בצע טרנספקציה או טרנסדוקציה של קווי התאים המתאימים עם הפלסמידים לביטוי חלבוני היתוך של mCherry ו-GFP. תחזק את התרביות תחת ברירה תרופתית ובדוק מעת לעת את הביטוי של החלבונים הפלואורסצנטיים ביום שלפני רכישת הדמויות. קצור את התאים באמצעות טריפסין.
לאחר מכן, זרעו תרבויות בצפיפות נמוכה על פלטות זכוכית עם תחתית פלואורו בקוטר 3.5 סנטימטר. פרוטוקול זה פותח באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי בעל דיסק מסתובב מסוג Zeiss cell observer SD, המצויד במעמד axio observer Z one. ראשית, ודאו שגז ה-CO2 זורם למודול ה-CO2 של מערכת האינקובציה. אם המיקרוסקופ נתמך על ידי שולחן אוויר (Airtable) נגד רעידות, הפעילו את אספקת האוויר עבור שולחן האוויר.
כעת הפעילו את החשמל עבור יחידת הדיסקים המסתובבים של מעמד המיקרוסקופ, המצלמות, מודול האינקובציה, המאיר HXP, הבמה הממוטרת, לייזר הארגון והמחשב. הפעילו את המתגים עבור קווי הלייזר שבהם תעשה שימוש. הפעילו את תוכנת Axio vision.
ניתן להתאים אישית את תוכנת Avision באמצעות חלונות ותפריטים נגללים הספציפיים למיקרוסקופ ולרכיבים שהוא שולט בהם. בשל כך, לכל ממשק משתמש עשוי להיות מראה ייחודי. כשעה לפני ביצוע ההדמיה, אתרו את הבקרים של האינקובטור והפעילו את החימום עבור התא העליון ופלטת השולחן.
הגדירו את הטמפרטורה ל-37 °C. הפעילו את בקרת ה-CO2 והגדירו את הרמה ל-5%. בחרו את עדשת העצם לצילום במחקר זה. עדשת העצם דורשת שימוש בתוסף טבילה בעל מקדם שבירה הדומה לזה של מים.
אם עליכם לדגמי תמונות ממספר מיקומים לאורך פרקי זמן ממושכים, ודאו כי השתמשתם בכמות מספקת של חומר טבילה כדי למנוע את התייבשותו של המיקרוסקופ. הניחו את צלחת התרבית על הבמה והביאו את עדשת העדשה למגע עם התחתית, באמצעות בקרים של המיקרוסקופ או באמצעות התוכנה. כוון את האור הנפלט לעיניות ובחרו את סט המסננים רחב השדה המתאים לאות הפלואורסצנציה הרלוונטי.
כעת התבוננו דרך העדשות האוקולריות. התמקדו בתמונה ואתרו שדה תאים מתאים באמצעות התוכנה או בקרים של המיקרוסקופ. הפנו את האור הנפלט הרחק מהעדשות האוקולריות אל הפורט עם יחידת הדיסק המסתובב הקונפוקאלית בתוכנה.
הדליקו את הלייזר המתאים למחקר זה. עבור כל ערוץ, כווננו את עוצמת הלייזר באמצעות כוונון בקר המסנן האופטי הניתן לכיוונון של kuo לרמה המתאימה. לאחר מכן, בחרו את המראה הדיכרואית ואת מסנני הפליטה המתאימים.
פתחו את התריס של יחידת הדיסק המסתובב. כעת בחרו את חלון התצוגה החיה (live window) כדי להציג את שדה הראייה הנוכחי. כעת פתחו את חלון בקרת המצלמה.
בחר את המצלמה לשימוש והגדר את זמן החשיפה לכ-100 milliseconds. כוונן את האחוזים ואת ה-EM gain לפי הצורך. כמו כן, פתח את בקרת יחידת ה-confocal spinning disc וכוונן את מהירות הדיסקה על ידי הזנת זמן החשיפה של המצלמה שהוגדר לצילום תמונה מתאימה.
לחץ על set כדי לשמור את השינוי. כעת פתח את חלון הרכישה הרב-ממדית (multi-dimensional acquisition). בחר בלשונית הערוצים (channel) וטען או בחר את הערוצים המתאימים שהוגדרו עבור ה-Flora Fours.
כדי להבטיח רישום תמונות (image registration), השתמש במראה דיכרואית משותפת עבור שני הערוצים. הגדר את התוכנה למיקוד אוטומטי (auto focus). עבור לחלון ה-MDA ולחץ על לשונית ה-ZS stack.
בחרו בערימת ZS במיקום המיקוד הנוכחי. הגדירו טווח עבור ערימת Z של 10 micron ובחרו באופציה אופטימלית למספר השלבים כדי להבטיח דגימת ניקוויסט לאורך ציר Z. כעת לחצו על start ונתחו את תמונת ערימת ה-Z שהתקבלה. בחרו בלשונית הזמן.
קבעו את המרווח בין נקודות הזמן של הדימות ואת משך הזמן הכולל של הסשן. עבור דימוי רב-נקודתי של מספר תאים בתוך הצלחת, פתחו את חלון ה-MDA. בחרו בלשונית position ווודאו שההגדרה apply setting before or after time point per position מסומנת.
כעת בחרו בסימון (mark). אתרו את השטח באמצעות התצוגה החיה, הזִיזו את הצלחית ובחרו שדות ראייה מתאימים. לחצו על start בתפריט הרכישה הרב-ממדית (multidimensional acquisition) כדי להתחיל את הניסוי ולהקליט סרטון ביקורת.
המשיכו בהוספת הטיפול המתאים והקליטו את הסרטון הניסויי במרווחי זמן קבועים למשך תקופה מוגדרת. עבור שורת תאים זו ולמעקב אחר תהליך המיטוזה כולו, השתמשנו במרווח של שבע דקות וחצי למשך ארבע עד חמש שעות. יהיה עליכם לקבוע את ההגדרות הספציפיות עבור שורת התאים שלכם ועבור הנושא שברצונכם לחקור.
פתחו את תוכנת velocity, צרו וקבעו שם לספרייה חדשה וייבאו את קובצי הווידאו הניסיוניים לצפייה בקבצים. נסו להשתמש בהגדרת המיקוד המורחב (extended focus) והתאימו את הסרטונים לפי הצורך. Velocity מצוידת במגוון כלים המסייעים בשיפור איכות התמונות שהושגו.
אם הגדרות המיקרוסקופ יהיו מתאימות, הדבר יחסוך זמן רב בשלב העריכה המאוחר יותר. לעיתים קרובות מומלץ לבצע דבלופ (devolve) לתמונות ולהתאים את הבהירות והניגודיות; הצרכים הספציפיים ישתנו בהתאם לניסוי שלכם. כדי לצפות בתאים בתלת-ממד, עברו להגדרת השקיפות התלת-ממדית (3D opacity).
דבר זה מאפשר סיבוב של התאים המרונדרים בתלת-ממד במרחב, ובכך מספק נקודות מבט מרובות של מבנים בעלי עניין בתוך התאים.סרטונים. ניתן לייצא תמונות סטטיות למגוון סוגי קבצים בהתאם להעדפת המשתמש בהשוואה לבקרות. תאי פיברובלסט שנחשפו ל-CPT יצרו מוקדי ריכוז (foci) בתוך חמש עד 10 דקות ושמרו על מוקדים אלו לאורך משך ההקלטה.
מעניין לציין כי בתאי כליה עובריים של בני אדם, 53 BP one מנתק את קשרו מהכרומטין עם תחילת המיטוזה, ויוצר מעין ערפל דליל סביב הכרומוזומים המתעבים. עם התרחשות הטלופאזה וסיומה של המיטוזה, 53 BP one מצטבר שוב למוקדים מובחנים. אנו מקווים שסרטון זה יאפשר לכם ללמוד את ההקשרים המרחביים-זמניים של חלבונים המעורבים בתגובה לנזקי DNA וכן של מסלולים אחרים.
לדוגמה, בתחום הדינמיקה של כרומטין, נעשה שימוש בטכניקה זו כדי לחקור כיצד קישור של 53 BP1 משפיע על תנועת הקצוות הטלומריים של ה-DNA. לאחר יצירת תאים שעברו שינוי גנטי, ניתן לבצע דימות תאים חיים בדו-ממד ובתלת-ממד תוך כארבע עד שמונה שעות. ודאו כי הגדרות המיקרוסקופ כווננו כראוי כדי להבטיח דימות אופטימלי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה להדמיית חלבון סיגנל של שבירת גומש כפול ב-DNA המופעל בתגובה לנזקי DNA, וכן את מיקומו במהלך המיטוזה. ההדגמה עושה שימוש בהדמיה של תאים חיים בדו-ממד ובתלת-ממד כדי לחקור את היחסים המרחביים והזמניים של חלבונים המעורבים בתגובה לנזקי DNA.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביולוגיה של התא
- תגובה לנזקי DNA
- דימוי תאים חיים
רקע
- הבנת תגובת הנזק ל-DNA היא קריטית לוויסות מחזור התא.
- סמנים פלואורסצנטיים מסייעים להדמיות של דינמיקת חלבונים בתאים חיים.
- טכניקות דימוי בדו-ממד ובתלת-ממד משפרות את הניתוח המרחבי והזמני.
- 53 BP1 הוא חלבון מפתח המעורב בתגובת הנזק ל-DNA.
מטרת המחקר
- להדמיית ההפעלה והמיקום של חלבוני איתות של נזקי DNA.
- לניתוח השפעותיהם של גורמים הגורמים לנזקי DNA על הדינמיקה התאית.
- לבדיקת התנהגותם של חלבונים במהלך המיטוזה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בצע טרנספקציה או טרנסדוקציה של שורות תאים עם קונסטרוקטים של סממנים פלואורסצנטיים.
- הקלט סרטוני ביקורת של תאים המסומנים פלואורסצנטית בתנאים רגילים.
- החל את הטיפולים והקלט נתונים על השפעות הטיפולים.
- נתח את נתוני הווידאו כדי לבחון קשרים מרחביים-זמניים של חלבונים.
תוצאות עיקריות
- מיקרוסקופיית פלואורסצנציה של תאים חיים חושפת את הדינמיקה של היווצרות מוקדי 53 BP1.
- התנהגות החלבון במהלך המיטוזה מושפעת מגורמים הגורמים לנזקי DNA.
- הדמיה דו-ממדית ותלת-ממדית מספקת תובנות לגבי תגובות תאיות לטיפולים.
- ניתן לנתח ביעילות יחסי מרחב-זמן של חלבונים.
מסקנות
- שיטה זו מאפשרת תצפית מפורטת על חלבונים המגיבים לנזקי DNA.
- דימוי תאים חיים הוא כלי רב עוצמה לחקר דינמיקה תאית.
- הבנת תהליכים אלו יכולה לסייע בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות נגד נזקי DNA.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למקבלי החלטות
דימוי תלת-ממדי (3D) ודו-ממדי (2D) של תאים חיים עבור חלבוני תגובה לנזקי DNA, כגון 53BP1, מאפשר ויזואליזציה ישירה של דינמיקה חלבונית מרחבית-זמנית בעקבות דחק גנוטוקסי. יכולת זו תומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים ובביטחון חזוי בשלבי הגילוי המוקדמים, במיוחד עבור מטרות ומסלולים המעורבים ביציבות גנומית. שילוב של גישות דימוי אלו מסייע בתהליכי תיקוף מטרות ובקבלת החלטות לגבי סיווג תיקי פיתוח בתוכניות לאונקולוגיה ולתחזוקת הגנום.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה בזמן אמת של הפעלת מסלולי תיקון DNA וגיוס חלבונים.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות DDR באמצעות ויזואליזציה של לוקליזציית חלבונים וקינטיקה.
- מסייע בהסרת סיכונים מכניסטיים על ידי הבהרת המעורבות של המסלול וההקשר התאי.
- מעניק ביטחון חיזוי להעמדת מודולטורים של DDR או אסטרטגיות של לטליות סינתטית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מבסס מערכות תאים חיים שעברו ולידציה להערכה כמותית של דינמיקת חלבוני DDR.
- מאפשר מדידה הדירה של היווצרות מוקדים (foci) ושינויים בכרומטין לאחר טיפול.
- תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה לסריקת תרכובות המכוונות למסלולי תיקון DNA.
- מאפשר התאמה ניתנת להרחבה למספר רב של סוגי תאים ורקעים גנטיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את פלטי התמונה למודלים של חוסר יציבות גנומית הרלוונטיים למחלה.
- מספקת רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של סוכנים המכוונים ל-DDR.
- מאפשרת קידום מותאם סיכונים על ידי קישור מדדים מכניסטיים לנקודות קצה תרגומיות.
- תומכת בפיתוח סמנים ביולוגיים למעקב אחר מעורבות של מסלול ה-DDR.
שילוב זרימת עבודה וצנרת עיבוד
שיטת דימות זו משתלבת בממשק שבין הגילוי המוקדם לזיהוי מובילים (lead identification), ותומכת הן בתיקוף מטרות מונחה-השערות והן בפיתוח בדיקות המשך עבור תוכניות המתמקדות ב-DDR.
- ביולוגיה של הגילוי: מאפשרת ויזואליזציה של גיוס חלבונים ושינוי מבנה הכרומטין בתגובה לנזק ל-DNA, ובכך מבהירה את תפקוד המסלול.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות וניתנות לשחזור של מוקדי חלבוני DDR לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה של דינמיקה מרחבית-זמנית של חלבונים והשוואה בין טיפולים או בין שורות תאים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין תוצרי הדמיה מכניסטיים למודלים רלוונטיים למחלות ולאסטרטגיות של סמני ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר לחקר חלבונים ומסלולי DDR מגוונים במגוון פרויקטים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות DDR.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של תהליכי עבודה של דימיוג תאים חיים לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות go/no-go ולהקצאת הון באמצעות אספקת נתונים מכניסטיים חסונים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעודוף מותאם סיכון של נכסים המכוונים ל-DDR ואסטרטגיות של ביומרקרים תרגומיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדימוי תאים חיים, הנדסת חלבונים פלואורסצנטיים וניתוח תמונות.
- דורש גישה למיקרוסקופיה קונפוקלית מתקדמת ומערכות לבקרת סביבה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי דימוי ושל תהליכי (pipelines) ניתוח נתונים.
- ניתן להתאמה לקווי תאים שונים ולחלבונים של DDR באמצעות תכנון מתאים של הקונסטרוקט.
- יש להבטיח אופטימיזציה של תנאי הדימוי כדי למזער פוטו-בליצ'ינג (photobleaching) ולהבטיח את איכות הנתונים.
