מערבלים microfluidic ללימוד קיפול חלבונים

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לערבב במהירות שני תמיסות כדי להתחיל תגובה ביוכימית בלוח זמנים של מיקרו-שנייה. דבר זה מושג תחילה על ידי ייצור של מיקסר מיקרו-פלואידי. השלב השני הוא הדבקת שבב לזכוכית כיסוי כדי לאטום את התעלות.

בשלב הבא, השבב מורכב למניפולטור (manifold) המכיל את מאגרי התמיסה. השלב הסופי הוא הדמיה של התמיסה המעורבבת באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקאלית. בסופו של דבר, התגובה הביוכימית נלכדת בלוח זמנים של מיקרו-שניות על ידי המרת המרחק לאורך תעלת היציאה לזמן.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ערבוב בשיטת stop flow, הוא שהערבוב אינו מוגבל על ידי טורבולנציה ומתרחש בתוך מיקרו-שניות בודדות. שיטה זו עשויה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום קיפול החלבונים, כגון מתי מתרחש קריסה הידרופובית? את הפרוצדורה תדגים לינג וו, פוסט-דוקטורנטית במעבדתי, כדי להתחיל בייצור של שבבי ערבוב מיקרופלואידיים.

ראשית, נקו פרוסות סיליקה FU של ארבעה אינץ' באמצעות תמיסת פיראנה טרייה כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב המצורף לסרטון זה. לאחר מכן, השתמשו בתנור לשיקוע כימי מאדיים בלחץ נמוך כדי להחיל ציפוי פוליסיליקון בעובי של כמיקרון אחד עבור כל 10 מיקרון של עומק התעלות המיקרופלואידיות הסופיות. לאחר טיפול נוסף בפרוסות כפי שמתואר בטקסט, בצעו ציפוי ספין (spin coat) לפרוסות בשכבה בעובי של 900 ננומטר של פוטו-רזיסט Z 52 14, ולאחר מכן בצעו אפייה רכה (soft bake) בטמפרטורה של 90 °C ישירות על פלטה חמה למשך דקה אחת, או בתנור בטמפרטורה של 110 °C למשך 30 דקות.

לאחר יישור מסכת הפוטו (photo mask), צרו מגע קשיח בואקום על ידי חשיפה ראשונית של הפוטורזיסט (photo resist) לאור UV למשך מספר שניות. לאחר מכן, פתחו את התבנית בפוטורזיסט כפי שמופיע בפרוטוקול הכתוב. בחנו את המבנים על גבי הפרוסה (wafer) באמצעות מיקרוסקופ ובצעו אפייה קשיחה (hard bake) בטמפרטורה של 115 °C ישירות על פלטה חמה למשך שתי דקות.

לאחר מכן, בצעו DCU לפרוסות הסיליקון באמצעות Asher או פלזמה של חמצן למשך 2.5 דקות בהספק RF של 100 watts. באמצעות תכונן חריטה יונית עמוקה (deep reactive ion etcher), חרטו את שכבת הפולי-סיליקה עד להגעה לסיליקה המותכת (fused silica) שמתחתיה. הסירו את שאריות הפוטורזיסט וטפלו בפרוסת הסיליקון כפי שהורה הטקסט.

מדדו את עומק התעלה כדי לוודא שהיא חודרת באופן מלא דרך ציפוי הפולימר. באמצעות מכשיר לתסריס יונים עמוק (deep reactive ion etcher) המסוגל לתסריס תחמוצות, בצעו תסריס של סיליקה מותכת (fused silica) לעומק של כ-10 מיקרונים עבור כל מיקרון עובי של ציפוי הפולימר. נקו את הפרוסה באמצעות matrix Asher למשך ארבע דקות, בהספק RF של 100 ווטים, והסירו את הפוליסיליקון באמצעות תסריס xenon di fluoride. לפני קידוח חורים בפרוסה, בצעו ציפוי סבב (spin coat) של שכבת פוטו-רזיסט חדשה בעובי מיקרון אחד כדי להגן על התעלות במהלך הטיפול הבא.

לאחר מכן, הצמידו את הפרוסה כאשר צד התכונות פונה כלפי מטה על לוח זכוכית להקרבה באמצעות Aqua Bond 55. תוך הקפדה לשמור על החיבור ללא בועות, קררו מקדח בעל קצה יהלום הנשלט במחשב עם תמיסת ניקוי micro 90. פעולה זו מונעת מרסיסי זכוכית קטנים להידבק לתעלות, מה שעלול לגרום לסתימה של השבב במהלך השימוש.

המשיכו לקדוח חורי כניסה ויציאה בכל שבב. שטפו את הפרוסה במים דאיוניים באמצעות מזרק להזרקת מים לתוך כל חור. לאחר מכן, השרו במים עם סבון למשך שעה לאחר הסרת הפוטו-רזיסט.

יש להחיל רזיסט וחומר הדבקה (bonder) כפי שמתואר בטקסט. שטפו את הפרוסה במים דה-יוניים ובמים חמימים עם סבון. שטפו שוב כל חור באמצעות מזרק, תוך הימנעות ממגע עם התכונות שנחרטו, לאחר הזרמת חנקן על הפרוסה.

המשך לייבש בתנור ואקום המכוון ל-120 °C. בדוק את החורים כדי לוודא שהם נקיים משאריות חול וחזור על שלבי הניקוי במידת הצורך. את השלבים הבאים יש לבצע בחדר נקי.

מדדו את עומק התעלות באמצעות פרופילומטר פני שטח אופטי או מכני. נקו את הפרוסה וכן זכוכית כיסוי מסיליקה מותכת (fuse silica) כפי שמתואר בטקסט בחדר נקי. ייבשו את הפרוסה ביסודיות באמצעות גז חנקן למשך חמש דקות לפחות.

לאחר מכן, הניחו את הפרוסה כאשר הצד עם התכונות פונה כלפי מעלה על גבי ערימה של שלושה עד ארבעה מגבוני חדר נקיים, שהונחו על משטח קשיח ושטוח, כגון לוח זכוכית קטן. חזרו על הפעולה עם זכוכית הכיסוי. הרימו את זכוכית הכיסוי מהקצה והפכו אותה כך שצד הפוליש פונה כלפי מטה מעל הפרוסה.

יישרו את הקצוות השטוחים בזהירות, הניחו את זכוכית הכיסוי על גבי הפרוסה והמתינו עד שתתמקם; דחפו אותה אופקית בלבד כדי לדייק את היישור. לחצו בעזרת אצבע אחת על מרכז הפרוסה. ניתן יהיה להבחין בחזית הידבקות המתפשטת כלפי חוץ.

במידת הצורך, הפעל לחץ נוסף במיקומים אחרים מסביב לווייפר כדי לקדם את חזית ההדבקה. לאחר הנחת הווייפרים האטומים בתנור בטמפרטורה גבוהה המתוכנת לפי פרופיל הטמפרטורה המפורט בטקסט, חתוך את הווייפר באמצעות מסור לחיתוך וייפרים לשבבים בודדים. ניתן להכין את המניפולטור להחזקת שבב הערבוב והתמיסות מפלסטיק כגון lexan או plexiglass, או מאלומיניום.

לבקרת טמפרטורה, חברו את השבב למניפולד באמצעות טבעות O קטנות וקבעו אותו במקומו בעזרת טבעת אבטחה המאפשרת ראות אופטית ברורה של מרכז השבב. חריצי טבעות ה-O צריכים להיות רדודים יותר מהסטנדרט כדי להבטיח התאמה טובה מבלי להפעיל לחץ רב מדי על השבב. לאחר התקנת השבב, הוסיפו תמיסות למאגרים המרכזיים והצדדיים, תוך הקפדה על שחרור בועות אוויר כלשהן שנלכדו בתחתית הבארות.

הנח את המניפולד על מיקרוסקופ הפוך ובחן את אזור הערבוב באמצעות העינית או פלט המצלמה. פנס להט שיונח מעל המניפולד יספק תאורה מספקת. השתמש בצבע או בתמיסה בעלת מקדם שבירה גבוה בתעלה המרכזית כדי לצפות בסבך.

מכיוון שהנפחים המשמשים במערבל זה הם קטנים מאוד, ניתן לשלוט בזרימה באמצעות לחץ אוויר המופעל מעל בארי התמיסות. כדי להדמיאן את הסילון, התחילו עם לחץ אפס psi בערוץ הצד והגבירו אותו לאט עד להשגת לחץ שווה לזה של הערוץ המרכזי. אם אחד מערוצי הצד סתום, הסילון יידחף לעבר אחד מקירותיה של תעלת היציאה.

אם מופיעה סתימה נראית לעין, ניתן לשחרר אותה על ידי הפעלת לחץ או ואקום בערוץ היציאה באמצעות מזרק. אם חלבון או חומר אורגני אחר סותמים את השבב, ניתן לנקות אותו על ידי השריה בתמיסת piranha למשך לילה. הכניסו קרן לייזר מצופה לתוך מיקרוסקופ ברמה מחקרית באמצעות מראה דיכרואית, בתוך המיקרוסקופ או ממש מחוצה לו.

יישרו את הלייזר כך שניתן יהיה לראות את המוקד בעין או במצלמה בקרבת אזור הערבוב. פלואורסצנציה מהחלבון בערבוב נאספת על ידי העדשה ומועברת דרך המראה הדיכרואית, ממוקדת על ידי עדשה אל תוך חור סיכה (pinhole) ומדומיינת על גבי מונה פוטונים. סרקו את השבב באמצעות סורק פייזו-אלקטרי בצירים x ו-y כדי לדמיין את אזור הערבוב.

בחרו מיקום על הסילון ובצעו סריקה בצירים X ו-Y כדי למצוא את המוקד במרכז התעלה בצורה אנכית. עומק השדה של המיקרוסקופ קטן בהרבה מעומק התעלה, וקצב הזרימה בתעלה הוא אחיד למעט במרחק של מיקרון אחד מהדפנות. לפיכך, הרזולוציה הזמנית של הפלואורסצנציה הנצפית נקבעת בעיקר על ידי גודלו של המוקד הקונפוקאלי.

בצעו סריקה אופקית בתוך תעלת היציאה במרווחים של 100 micron לאורך הסילון, תוך תצפית של כמילישנייה אחת לכל מיקום. הזיזו את בסיס המיקרוסקופ ב-80 עד 90 micron לאורך הסילון כדי ללכוד זמנים מאוחרים יותר. לחלופין, ניתן לגשת לגילוי האור באמצעות ספקטרוגרף ו-CCD אחרי המראה הדיכרואית, תוך שימוש בעדשה למיקוד האור על חריץ הכניסה.

כיוון שאיסוף הנתונים איטי יותר מאשר במונה הפוטונים, בדרך כלל מצלמים תחילה את הסילון באמצעות מונה הפוטונים, ולאחר מכן מודדים נקודות לאורך הסילון באמצעות הספקטרוגרף. נתונים ממונה הפוטונים מנותחים על ידי סיכום של שלושה עד חמישה פיקסלים מסביב לסילון בכל מיקום, כדי ליצור גרף של עוצמה לעומת מרחק. הזמן מחושב מהמרחק באמצעות מהירות מחושבת המבוססת על הלחצים המופעלים.

כשלב סופי, נתחו את הנתונים מהספקטרוגרף באמצעות אחת השיטות המתוארות בטקסט. מוצג כאן תרשים קונטור של העוצמה באזור הערבוב שנמדדה על ידי מונה הפוטונים. הרקע בערוץ היציאה מחוץ לסילון צריך להיות קרוב לרצפת הרעש של הגלאי ובדרך כלל אינו מופחת.

רקע גבוה יותר עשוי להצביע על יישור לקוי או על כך שהחלבון נדבק לדפנות התעלה. לעומת זאת, סילון שנראה מקופל או עקום, במיוחד סמוך לאזור הערבוב, מעיד על תכתוש (etch) לקוי של הדיזות. מוצג ספקטרום ברזולוציית זמן של חלבון ACell coenzyme a binding protein או A CBP המסומן ב-Alexa 488 וב-Alexa 647.

המלבנים הירוקים והאדומים מראים את אורכי הגל שהוגדרו כערוצי התורם והמקבל, בהתאמה. נתונים אלה עברו חיסור רקע כדי להסיר את מטען החושך ואת אות הלייזר. אות הרקע נלקח כאשר הלחץ בערוץ המרכזי היה אפס pounds per square inch.

ניתן למדוד את זמן הערבוב על ידי מדידה של תגובה מהירה שהיא מהירה בהרבה מהערבוב, כגון כיבוי פלואורסצנציה של tryptophan על ידי potassium iodide. מכיוון שהסילון קטן מהרזולוציה האופטית של המיקרוסקופ, חלה ירידה משמעותית בעוצמה באזור הערבוב. בעת היווצרות הסילון, ניתן להסיר תגובה זו של המכשיר על ידי ביצוע מדידת ביקורת שבה לא משנים את תנאי התמיסה.

איור זה מציג את היחס בין ניסויי ערבוב לניסויי אי-ערבוב של פלואורסצנציה של N-Acetyl tryptophan amide. הקו מציג את הריכוז החזוי של potassium iodide מתוך מידול וסימולציות של console multiphysics. זמן הערבוב, כפי שנמדד על פי הזמן הדרוש לירידה של 80% בריכוז, הוא שמונה מיקרו-שניות.

תרשים זה מציג את השינויים ב-fret בחלבון A CBP לאחר דילול של חומר דנטורציה מריכוז של six molar ל-0.06 molar. נתונים אלו אינם דורשים ניסוי ביקורת. מכיוון שה-fret הוא כבר יחס ותגובת המכשיר כבר הוסרה, הקפיצה המהירה סמוך ל-T ששווה לאפס מייצגת שינוי מהיר באות ה-fret בתוך זמן הערבוב.

בעקבות פיתוח זה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום קיפול חלבונים לחקור את השלבים המוקדמים ביותר ביצירת מבנה החלבון.