בחינה של בחירה חיובית ושלילית הרתי ידי זרימת cytometry

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבחון את התפתחות התאי הטימוס בעכברים באמצעות ציטומטריית זרימה. דבר זה מושג על ידי הכנת תרחיפי תאים בודדים מהטימוס ומהטחול של העכבר. כשלב שני, התאי הטימוס (thymocytes) והספלנוציטים נצבעים בתערובת של נוגדנים לזיהוי אוכלוסיות תאי טימוס ספציפיות.

בסופו של דבר, ניתן להעריך את התדירות והמספר של אוכלוסיות לימפוציטים שונות באמצעות אנליזה של ציטומטריה זרימתית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בהתפתחות תאי T, כגון אילו גנים ומסלולים חשובים ליצירת רפרטואר תאי T פונקציונלי אך טולרנטי. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי התפתחות תאי T בטימוס, ניתן ליישמה גם בבחינת ההתפתחות של תאי מערכת חיסון אחרים.

בדרך כלל, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בתכנון תערובות הנוגדנים (antibody cocktails) עבור ציטומטריה זרימה. לפני תחילת הניתוח, הניחו רשת פלדה סטרילית בתוך צלחת פטרי בגודל 60 על 15 מילימטר. לאחר מכן, הוסיפו לצלחת 5 milliliters של HBSS ושמרו את הצלחת על קרח לצורך קציר הטימוס.

ראשית, השתמשו בפינצטה כדי להרים את הקצה התחתון של עצם החזה ולחשוף את הסרעפת. לאחר מכן, תוך הימנעות מהכבד, חתכו את הסרעפת כדי להפריד את כלוב הצלעות, ואז חתכו את כלוב הצלעות בכיוון כלפי מעלה מכל צד. הקפידו להימנע מפגיעה בריאות ובלב.

כעת השתמשו בפינצטה כדי למשוך בעדינות את כלוב הצלעות לאחור. התימוס הוא איבר לבן בעל שתי אונויות הממוקם מעל הלב. השתמשו בקצה השטוח של הפינצטה כדי לתפוס את בסיס האונויות.

לאחר מכן, משכו בעדינות את התימוס החוצה והניחו אותו על אחד מרשתות המסננת שהוכנו מראש. כדי לאסוף את הטחול, בצעו חתך דרך הפריטונאום כדי לחשוף את חלל הבטן. הטחול הוא איבר אדום בצורת גלשן הממוקם בצדו השמאלי של חלל הבטן של העכבר, מתחת לכבד.

לאחר מכן, השתמשו בזוג פינצטות אחד כדי לשלוף את הטחול ובזוג שני כדי להפריד את רקמת החיבור. לאחר מכן, הניחו את הטחול המבודד על רשת נפרדת. כעת, השתמשו בבוכנה של מזרק של 3 mL כדי לרסק כל איבר על הרשת שלו עד שנותרו רק רקמת חיבור ושומן; העבירו בעזרת פיפט את התאים וה-HBSS לשפופרת קונית של 15 mL.

לאחר מכן, שטפו כל רשת עם HBS S טרי 3 פעמים. בשלב הבא, הגישו את התאים למשקע (pellet) למשך חמש דקות ב-335 ×g ובטמפרטורה של 4 °C. לאחר שאיבת הנוזל העליון (supernatant), השעיקו את התאים ב-500 µL של בופר ליזיס CK למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, בזמן שתאי הדם האדומים של הטחול עוברים ליזיס.

השעה את התיימוציטים בריכוז של 20×10⁶ תאים למ"ל בבופר FACS, והשאר אותם על קרח. כעת הוסף 5 מ"ל של HBSS כדי להחזיר את התאים לאיזוטוניות לאחר סבב סבוב נוסף של התאים; השעה מחדש את המשקע הנקי מתאי דם אדומים בריכוז של 20×10⁶ תאים למ"ל בבופר FACS. התחל שלב זה על ידי חלוקה למנבובות (Aliquotting).

העבירו 4×10⁶ תאי THYMOCYTES שמורים לכל דגימה של ציטומטריית זרימה לכל באער של פלטת 96 באערים. לאחר מכן, הוסיפו תאים לבאערים של פלטת 96 באערים עבור בקרות פיצוי (compensation controls). לאחר מכן, חסמו את קולטני ה-FC בכל אחת מדגימות התאים על ידי דגירה עם anti CD 1632 למשך 10 דקות על קרח.

כעת סובבו את הפלטה בצנטריפוגה ולאחר מכן רוקנו את הנוזל מהבארות על ידי ניעור חד-פעמי של הפלטה כשהיא הפוכה לתוך כיור, לאחר מכן השהו שוב כל באר ב-200 µL של תמיסת fax buffer וחזרו על השטיפה. בשלב הבא, דגרו את הדגימות הניסיוניות עם 200 µL של תערובת נוגדנים (antibody cocktail) או נוגדנים המצומדים לכרומופור פלואורסצנטי בודד עבור בקרות הפיצוי (compensation controls). הכל בתמיסת fax buffer, על קרח ובחושך.

לאחר 30 דקות, שטפו את התאים פעמיים בבופר fax ולאחר מכן, לאחר תליה מחדש של התאים בבופר fax, העבירו את הדגימות לשפופרות fax במודלים פיזיולוגיים של TCR טרנסגני ובעכברים מסוג wild type. סלקציה חיובית מתחילה בשלב ה-double positive bright לפני המעבר לשלב ה-double positive dull. לאחר מפגש עם אנטיגן, תימוציטים מסוג double positive dull נכנסים לשלב מעבר של CD four positive CD eight low לפני שהם הופכים ל-CD four.

תימוציטים חיוביים בודדים (Single positive) או תימוציטים חיוביים בודדים ל-CD8; תימוציטים חיוביים בודדים בוגרים מאופיינים בביטוי גבוה של TCR ובאובדן של CD24. בעוד שפרופיל של CD8 מול CD4 יכול לחשוף פגמים בברירה חיובית, בחינה של TCR beta מול CD69 או CD5 יכולה לספק תובנות נוספות לגבי מיקום הפגם. הן CD69 והן CD5 מוגרמים (upregulated) לאחר גרייה של TCR, כאשר אינטראקציות חזקות יותר מובילות לביטוי גבוה יותר של סמנים אלה.

בתרשים TCR beta מול CD 69 זה בעכבר מסוג wild type, השער (gate) של TCR beta low ו-CD 69 negative מייצג אוכלוסייה של תימוציטים כפולי-חיוביים (double positive) טרום-סלקציה. לעומת זאת, השער של TCR beta intermediate ו-CD 69 positive מייצג אוכלוסייה מעברית מיד לאחר מעוררות של TCR, והיא מורכבת מתאים כפולי-חיוביים בהירים (double positive bright), עם חלק מתאים כפולי-חיוביים עמומים (double positive dull) ותאים CD 4 positive ו-CD 8 low. כאן, השער של TCR beta high ו-CD 69 positive ממחיש את אוכלוסיית התאים מיד לאחר סלקציה חיובית, המורכבת מתאים כפולי-חיוביים עמומים, תאים CD 4 positive, תאים CD 8 low ותאים CD 4 single positive.

לבסוף, שער (gate) זה של TCR beta high ו-CD69 negative מראה אוכלוסייה בוגרת יותר של תאים, המורכבת בעיקר מתאים CD4 ו-CD8 single positive. היעדרם של אוכלוסיות TCR beta intermediate ו-CD69 positive וכן TCR beta high ו-CD69 positive עשוי להעיד על פגיעה בברירה חיובית (positive selection). שינויים ביחס בין תאי CD4 single positive לתאי CD8 single positive בתוך אוכלוסיית TCR beta high ו-CD69 negative עשויים להצביע על שינויים בהתמיינות השושלת (lineage commitment).

האובדן של האוכלוסיות TCR beta high CD 69 positive ו-TCR beta high CD 69 negative עשוי לשקף בעיות הישרדות בעקבות ברירה חיובית. בחינת TCR beta באמצעות CD five היא אסטרטגיה נוספת לזיהוי אוכלוסיות שלפני ואחרי ברירה חיובית. שתי האוכלוסיות הראשונות הללו מורכבות בעיקר מתימוציטים double positive bright.

אוכלוסיית ה-TCR beta low CD five low מייצגת תימוציטים כפולי חיוביים טרום-סלקציה, ואוכלוסיית ה-TCR beta intermediate CD five intermediate מורכבת מהתאים המתחילים את הסלקציה החיובית. יצירה לקויה של אוכלוסייה זו או של האוכלוסייה הקודמת מעידה על פגם בסלקציה החיובית. לעומת זאת, אוכלוסיית ה-TCR beta intermediate CD five high מייצגת תימוציטים בתהליך של סלקציה חיובית ומורכבת בעיקר מתאי double positive dull ותאי CD four positive.

תימוציטים בעלי ביטוי נמוך של CD8. אוכלוסיית ה-TCR beta high CD5 high מורכבת בעיקר מתאים לאחר סלקציה חיובית. תימוציטים חיוביים לסמן בודד (single positive) שינויים ביחס בין CD4 single positive לבין CD8.

תאים חיוביים בודדים בתוך אוכלוסייה זו, למרות אוכלוסיות קודמות תקינות, עשויים להצביע על שינויים במחויבות לשושלת תאים. יתרה מכך, היעדר אוכלוסייה זו עשוי להעיד על הישרדות מופחתת של תימוציטים בעקבות ברירה חיובית, שכן ברירה שלילית כוללת מחיקה של אוכלוסיות קטנות ספציפיות לאנטיגן. פגמים בתהליך זה נצפים בצורה הטובה ביותר באמצעות עכברים טרנסגניים ל-TCR; בתימוציטים של עכברי HY CD4 המבטאים את ה-H-Y-T-C-R הטרנסגני, ניתן לזהותם באמצעות הנוגדן המונוקלונלי T 3.7.

ה-H-Y-T-C-R מזהה את האנטיגן HY הספציפי לזכרים המוצג בתוך MHC Class one db. לפיכך, עכברים זכרים מסוג HY CD four עוברים סלקציה שלילית של תימוציטים חיוביים ל-H-Y-T-C-R, כפי שמעידה ירידה במספר התימוציטים כפולי-חיוביים החיוביים ל-T three point 70, וירידה דרמטית יותר במספר התימוציטים חד-חיוביים CD eight החיוביים ל-T 3.7. לעומת זאת, עכברים נקבות מסוג HY CD four עוברים סלקציה חיובית ליצירת תאי T חד-חיוביים CD eight החיוביים ל-T 3.7.

בעוד שירידה במספר התאימocytes כפולי-חיוביים מעידה על ברירה שלילית, היעדרם של תאימocytes חד-חיוביים ספציפיים לאנטיגן הוא המדד המדויק ביותר. בדיקה נוספת של מספר קטן של תאימocytes חד-חיוביים CD8 ו-T3.70 חיוביים בעכברי HY CD4 זכרים מגלה שרובם הם תאים לא בשלים עם ביטוי גבוה של CD24. לעומת זאת, רוב התאימocytes החד-חיוביים CD8 ו-T3.70 חיוביים בנקבת HY CD4 הגיעו לבשלות והם בעלי ביטוי נמוך של CD24, נתון המספק תמיכה נוספת לכך שברירה שלילית מתרחשת בעכברי HY CD4 זכרים.

הסתייגות אחת של מודלים טרנסגניים של TCR היא הקושי לאפיין באופן מעמיק יותר את הברירה החיובית על ידי זיהוי אוכלוסיות המבוססות על ביטוי של TCR ו-CD 69 או CD 5, וזאת בשל ביטוי גבוה של TCR לאורך התפתחות התיימוציטים. לעכברים נקבות HY CD 4 יש אוכלוסייה גדולה של תיימוציטים כפולי-חיוביים (double positive) חיוביים ל-T 3.70 שעוברים ברירה חיובית. כפי שמעידה עלייה באוכלוסייה החיובית ל-CD 69 בהשוואה לסוג בר, ברירה שלילית כרוכה בגירוי TCR בעל זיקה (affinity) גבוהה יותר מאשר ברירה חיובית. הדבר בא לידי ביטוי בביטוי גבוה יותר של CD 69 בתיימוציטים כפולי-חיוביים חיוביים ל-T 3.70 בעכברים זכרים HY CD 4, מה שמוביל להסטה של שיא ההיסטוגרמה ימינה.

מגמות דומות נצפות בביטוי של CD5 בעת ניתוח של ברירה תימוסית בעכברים שעברו מניפולציה גנטית. בחינת ביטוי של CD69 או CD5 יכולה לקבוע אם הפגם נעוץ באותת ה-TCR או בתוצאה נסמכת של גריית TCR. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בשעתיים וחצי להכנת התאים וצביעה, בתוספת שעה אחת נוספת לאיסוף נתונים בציטומטר הזרימה.

אם הפרוצדורה תבוצע כהלכה, כל עכבר נוסף יוסיף כ-30 דקות. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לטפל בתאי התימוס (thymocytes) בעדינות ולוודא שתכננתם את אסטרטגיית הצביעה מראש. בהמשך לפרוצדורה זו.

ניתן לבצע בדיקות נוספות, כגון בדיקות הרגה (killing assays) או בדיקות ייצור ציטוקינים, כדי להשיב על שאלות נוספות, כמו השאלה האם התיימוציטים שיוצאו פועלים כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו מנתחים את התפתחות אתרי התימוס באמצעות ציטומטריה של זרימה.