הקלטה תאית סימולטני של Motoneuron מותנה והחיל הופק על ידי יחידת המנוע שלה בעכבר למבוגרים
5 בדצמבר 2012
שיטה חדשה זו מאפשרת הקלטה התאית סימולטני של motoneuron אחת מבוגר עכבר והמדידה של הכח הנוצר על ידי סיבי השריר שלה. החקירה בשילוב של תכונות החשמליות ומכאניות של יחידות מוטוריות בבעלי חיים רגילים ועבר שינוי הגנטי היא פריצת דרך בחקר מערכת התוקפת.
המטרה הכללית של הליך זה היא לחקור את התכונות האלקטרופיזיולוגיות והמכווצות של יחידה מוטורית בודדת בעכבר, באמצעות ביצוע הקלטות תוך-תאיות של נוירונים מוטוריים in vivo. זאת מושג תחילה על ידי חשיפת חוט השדרה והשריר הרלוונטי. לאחר מכן, מחברים חיישן כוח (force transducer) לגיד של השריר.
לאחר מכן, מעבדים את הנוירון המוטורי באמצעות אלקטרודה תוך-תאית, ובכך גורמים להתכווצות של היחידה המוטורית המוקלטת. בסופו של דבר, ניתן לאפיין את התכונות האלקטרופיזיולוגיות של הנוירון המוטורי בו-זמנית עם התכונות המכווצות של היחידה המוטורית שלו. הדגמה חזותית של טכניקה זו היא קריטית, מכיוון ששלבי המיקרו-כירורגיה קשים מאוד ללמידה בשל גודלו הקטן של בעל החיים.
כדי להתחיל את הפרוצדורה, הרדימו עכבר על ידי הזרקה של pentobarbital sodium או תערובת של ketamine ו-xylazine באופן אינטרפריטוניאלי. ודאו כי לעכבר אין רפלקס צביטה של בהונות. לאחר מכן, בצעו חתך מעל הקנה באמצעות מספריים קהים והסיטו את העור לשני הצדדים.
לאחר מכן, קרעו את בלוטת הרוק בעזרת פינצטה קהה. כדי לחשוף שני שרירים דקים המכסים את הקנה, הפרידו בין שני השרירים כדי לחשוף את הקנה. השתמשו בפינצטת Dumont seven.
השחילו שני חוטים של תפר משי 4-0 מתחת לקנה הנשימה. לאחר מכן, בצעו חיתוך רוחבי בקנה הנשימה בין שתי טבעות סחוס. אך היזהרו שלא לחתוך את קנה הנשימה באופן מלא.
כעת, הכניסו את התבורה הקנהית (tracheal tube) במורד הקנה. אבטחו את שני צדי פתח ההחדרה על ידי קשירת התפרים מעליו. לאחר מכן, חברו את התבורה הקנהית למנשם עכברים ולמכשיר קפנוגרף (capnograph).
לאחר מכן, חברו את המנשם למקור חמצן טהור באמצעות שק תאימות (compliance bag). כווןו את פרמטרי המנשם כך שהעכבר לא יילחם מול ההנשמה המלאכותית, ושהלחץ החלקי של פחמן דו-חמצני בסוף הנשמה יהיה יציב בין 4% ל-5%. בשלב זה, חשפו את הוריד הג'וגולרי (jugular vein) בצד אחד של הצוואר באמצעות טכניקות של דיסקציה קהה.
הוריד הג'וגולרי (jugular vein) מתפצל לשני גזעים עיקריים, הוורידים הפציאליים הקדמי והאחורי. הפרד בזהירות את הווריד מרקמת החיבור שמסביבו. לאחר מכן, החלק שני חוטים של תפר משי (silk suture) במידה 6 תחת הווריד, והרחק אותם זה מזה ככל האפשר לאורך הווריד.
בשלב הבא, הניחו תסביך כלי דם קטן בצד הפרוקסימלי של הווריד וקשרו את הצד הדיסטלי של הווריד. בעזרת מספרי איריס דקים מאוד, בצעו חתך רוחבי קטן בווריד. היזהרו מאוד לא לחתוך את הווריד באופן מלא.
לאחר מכן, הכניסו קטטר צרנתי (French) במידה אחת שמולא מראש אל הפתח עד לתפסו של כלי הדם המחזיק את הווריד ואת הקטטר יחד. הסירו בזהירות את תפסו של כלי הדם. לאחר מכן, דחפו את הקטטר מספר מילימטרים נוספים אל תוך הווריד. אבטחו את הקטטר על ידי קשירתו בעזרת תפרים משני צידי נקודת ההחדרה.
בשלב הבא, חברו את אחד הקטטרים למזרק או למשאבת מזרקים להזרקת מינונים משלימים של חומרי הרדמה כגון פנטוברביטל, נתרן או קטמין קסילזין. חזרו על הפעולה עבור וריד נוסף וחברו את הקטטר השני למשאבת מזרקים לעירוי תו-ורידי איטי של תמיסת גלוקוז 4% המכילה 1% נתרן ביקרבונט ו-14% פלסמון. לבסוף, סגרו את עור הצוואר באמצעות תפרים.
לאחר מכן, החזירו את העכבר למנח שכיבה על הבטן. כעת בצעו חתך מקצה הירך ועד לגיד אכילס. הפרידו את העור מהשרירים שמתחתיו והקפידו שלא לפגוע בכלי הדם.
בשלב הבא, זהו את הקצה הקדמי של שריר הדו-ראשי של הירך (biceps femoris), הנראה כקו לבן המשתרע לאורך הירך. לאחר מכן, פתח בזהירות לאורך הקו מהברך ועד לעצם הירך. הפרד את השרירים כדי לחשוף את עצב השריר הפיקומסקי (sciatic nerve) שמתחת לשריר הדו-ראשי של הירך.
בצעו דיסקציה זהירה של ה-biceps femoris והסירו אותו. כדי לחשוף את העצב הסיאטי (sciatic nerve) ואת שרירי ה-triceps surae, זהו את העצב הטיביאלי (tibial nerve) בין העצב הפרוני המשותף (common peroneal nerve) לעצב הסוראלי (sural nerve). מבין הענפים השונים של העצב הטיביאלי, זהו את הענפים המעצבבים את ה-triceps surae מתוך הענפים העמוקים יותר.
באמצעות שמונה חيوטי משי OTT, קשרו את כל ענפי עצב הטיביאלי (tibial nerve) יחד, תוך השארת הענפים המעצבבים את שריר התלת-ראשי של השוק (tricep sury) שלמים. גזרו את עצב הטיביאלי רחוק ככל האפשר מהקשר. זהו את חוליות T 13 ו-L 1, כאשר T 13 היא החוליה האחרונה אליה מחוברות צלעות.
לאחר מכן, קבע את עמוד השדרה באמצעות תפסני Cunningham עבור חוליות השדרה משני צדדיו של T 13 ו-L one. יש להיזהר לא לדחוס את חוט השדרה, אלא להפעיל מתח קל על הציר האורכי. ודא שעמוד השדרה מקובע היטב על ידי לחיצה עדינה כלפי מטה באמצעות פינצטה.
באמצעות פינצטות R עדינות, הסִירו את הזיזים הסבכיים ולאחר מכן את הלמינות מעל T 13 ו-L 1 כדי לחשוף את חוט השדרה. לאחר מכן, מקמו אמבט פלסטיק בהתאמה אישית סביב חוט השדרה. לאחר מכן, אחרו את האמבט במקומו באמצעות חוט משי בדרגת 4-0.
לבסוף, ודאו שהאמבטיה אטומה למים על ידי איטום שלה עם חומר איטום מהיר (quick cast sealant). לאחר שהחומר התייבש, הסירו את הכותנה המכסה את חוט השדרה ומלאו את האמבטיה בשמן מינרלי. השתמשו במלחצת חולרים נוספת כדי להצמיד זקיר של אזור השכין.
כדי לתמוך באזור הגב של בעל החיים, השתמש במלקחיים שלישיים כדי לקבע את הגפה האחורית הימנית ואת הקרסול בזווית של 90 מעלות בברך, כאשר הגפה כפופה ב-90 מעלות בברך ובקרסול. הסר את הגזה המכסה את אזור הגפה האחורית. בצע דיסקציה לגיד אכילס מהרקמה שמסביב.
נתקו את השריר התלת-ראשי מהרקמה הסובבת ככל הניתן באמצעות מחט הברגה. השהילו תפר משי במידה 6-0 אל תוך גיד אכילס וקשרו קשר משולש סביב הגיד. לאחר מכן, מקמו את התחולב הכוח (force transducer) קרוב לקשר.
לאחר מכן, חברו את הגיד למתמר הכוח באמצעות חוט משי, וחתכו את חלקו הדיסטלי של הגיד. לאחר מכן, הכניסו שני תרעי פלדה אל-חלודה מתחת לפסציה של שרירי ה-triceps surae. תרעים אלו מחוברים למגבר AC חוץ-תאי.
להקלטת EMG, הניחו את עצב ה-triceps surae על הקתודה של אלקטרודת וו (hook electrode), כאשר האנודה נוגעת בשריר סמוך. לאחר מכן, גרו את עצב ה-triceps surae באמצעות פולס מרובע של 50 microsecond בעצימות עולה ובתדר נמוך, עד להשגת אמפליטודת התכווצות (twitch amplitude) מקסימלית. לאחר מכן, גרו את עצב ה-triceps surae באמצעות פולס מרובע של 50 microsecond בעצימות עולה ובתדר נמוך, עד להשגת אמפליטודת התכווצות מקסימלית.
איורים אלו מדגימים כיצד לזהות נוירון מוטורי מקבוצת ה-triceps surae. לאחר חדירה בעוצמת גירוי נמוכה, ניתן להבחין ב-EPSP מונוסינפטי רק בעוצמה גבוהה יותר. ה-EPSP עשוי להיות גדול מספיק כדי לעורר ספייק אורתוטרופי בעוצמת גירוי גבוהה עוד יותר, ובהתאם לחוק הכל או כלום.
ספייק אנטידרומי מופיע עם השהיה (latency) קצרה יותר מאשר ה-EPSP המונוסינפטי. אם מוזרם מספיק זרם דרך המיקרו-אלקטרודה כדי לעורר ספייק, ניתן להקליט פעילות EMG בשריר לאחר השהיה קצרה, ואחריה התכווצות שריר.
לאחר זיהוי הנוירון המוטורי, ניתן לאפיין את תכונותיו האלקטרופיזיולוגיות. לדוגמה, איור זה מדגים כיצד ניתן למדוד את התנגדות הקלט באמצעות פולסי זרם היפר-פולריזציה ודה-פולריזציה, ומיפוי השינויים בפוטנציאל הממברנה ביחס לכמות הזרם שהוזרקה. ניתן ללמוד גם על התכונות הכיווציות של היחידה המוטורית באמצעות פרוטוקולי גרייה שונים.
לדוגמה, ניתן להשיג את קשר התדר-כוח על ידי הזרקת פולסי זרם קצרים בתדרים שונים אל הנוירון המוטורי. לאחר מכן, ניתן לשרטט את הכוח במצב יציב (steady State) כנגד תדר פולסי הזרם כדי לחשוף עקומת תדר-כוח סיגמואידית. ברגע שהניתוח נשלט, חלק מטכניקה זו יכול להתבצע תוך שלוש שעות אם בוצעה בצורה מדויקת.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
שיטה זו מאפשרת הקלטה תוך-תאית סימולטנית של נוירון מוטורי בודד בעכבר בוגר ומדידה של הכוח המופק על ידי סיבי השריר שלו. חקירה משולבת זו מהווה התקדמות משמעותית בלימוד המערכת הנוירו-שרירית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- פיזיולוגיה של השריר
רקע
- הבנת יחידות מוטוריות היא קריטית למחקר נוירו-משרי (neuromuscular).
- תכונות אלקטרופיזיולוגיות יכולות לספק תובנות לגבי תפקוד הנוירונים המוטוריים.
- לימוד תכונות התכווצות מסייע בהבנת מכניקת השרירים.
- קיימים אתגרים בביצוע מיקרו-כירורגיה בבעלי חיים קטנים.
מטרת המחקר
- לחקור את התכונות האלקטרופיזיולוגיות של יחידה מוטורית בודדת בעכבר.
- למדוד את תכונות הכיווץ של סיבי השריר הקשורים לנוירון המוטורי.
- להעמיק את ההבנה של האינטראקציות בין הנוירון המוטורי לשריר.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- חשיפה של חוט השדרה והשריר המדובר.
- חיבור של מתמר כוח לגיד של השריר.
- גירוי של הנוירון המוטורי באמצעות אלקטרודה תוך-תאית.
- הקלטה סימולטנית של הפעילות החשמלית וההתכווצות של השריר.
תוצאות עיקריות
- אפיון מוצלח של התכונות האלקטרופיזיולוגיות של הנוירון המוטורי.
- מדידה של תכונות ההתכווצות של היחידה המוטורית הקשורה.
- הדגמת היתכנות הטכניקה במודל של בעל חיים חי.
- תובנות לגבי הדינמיקה של האינטראקציות בין הנוירון המוטורי לסיבי השריר.
מסקנות
- שיטה זו מספקת גישה מקיפה לחקר יחידות מוטוריות.
- היא מאפשרת ניתוח סימולטני של תכונות חשמליות ומכניות.
- הטכניקה בעלת ערך הן למחקרים בבעלי חיים רגילים והן בבעלי חיים שעברו שינוי גנטי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמכים ניהוליים
טכניקה זו מאפשרת בחינה ישירה של הקשר התפקודי בין האלקטרופיזיולוגיה של נוירונים מוטוריים לבין תפוקת הכוח של היחידה המוטורית בעכברים בוגרים, ובכך מספקת מערכת רלוונטית פיזיולוגית לתיקוף יעדים במחקר נוירו-שרירי. על ידי קישור הפעילות העצבית לתפקוד מכני, היא תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטית של היפותזות טיפוליות הנוגעות למעגלים מוטוריים בעמוד השדרה. גישה זו בעלת ערך ניבוי להערכת השפעת תרכובות על שלמות היחידה המוטורית במודלים של מחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי הקורלציה בין תכונות אלקטרופיזיולוגיות של נוירוני תנועה לבין ייצור כוח ביחידה המוטורית.
- ערך תפעולי: מספק מערכת רלוונטית למחלה להערכת מעורבות המטרה (target engagement) במודלים גנטיים או פרמקולוגיים של שיבוש מוטורי.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר קריאות כמותיות וסימולטניות של עירור עצבי והתכווצות שרירים לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- ערך תפעולי: תומך במדידה הדירה של תפקוד היחידה המוטורית תחת תנאים ניסיוניים שונים לצורך סריקת תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקל על סריקה פנוטיפית במודלים של עכברים בוגרים להערכת ההתאמה של סממנים ביולוגיים (biomarkers) תרגומיים בין פעילות עצבית לבין פלט תפקודי.
- ערך תפעולי: מאפשר רצף מגילוי המטרה ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי מדידת נקודות קצה אלקטרופיזיולוגיות ונקודות קצה של התכווצות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים על ידי אספקת מדדים תפקודיים המגשרים בין מודולציה של מטרות עצביות לבין תוצאה פיזיולוגית, ובכך היא תומכת בקבלת החלטות בנוגע לזיהוי מובילים (leads).
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על ידי קישור תכונות קלט של מוטוניורונים לפלט של כוח יחידת מוטור, ובכך מבהיר את תפקוד המסלול.
- סריקה: מספק מדידות כמותיות בעלי שני פרמטרים (אלקטרופיזיולוגיות וכוח) המוכנות לבדיקה, לצורך הערכה מהימנה של תרכובות.
- אנליזה: מאפשר השוואה סטטיסטית של תגובות יחידות מוטור תחת תנאים שונים באמצעות איסוף סימולטני של נתונים אלקטרופיזיולוגיים ונתוני התכווצות.
- מחקר תרגומי: מקשר בין מודולציה של מטרה עצבית לתוצאות תפקודיות במערכות הרלוונטיות למחלה, ובכך תומך ברציפות פרה-קלינית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר להערכת שלמות יחידות מוטור במגוון מודלים של מחלות ורקעים גנטיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי צמצום העמימות המכניסטית בין הת targeting העצבי לבין התפקוד המוטורי.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה של הערכת היחידה המוטורית באמצעות רישום אלקטרופיזיולוגי ורישום כוח מסונכרנים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי אספקת מדדים תפקודיים ישירים של מודולציית המטרה, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של תרכובות מותאם סיכון, בהתבסס על השפעתן על הפיזיולוגיה של היחידה המוטורית במודלים של מחלות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרו-כירורגיה, אלקטרופיזיולוגיה ושילוב של חיישני כוח (force transducers) עבור עבודות in vivo בבעלי חיים קטנים.
- תלוי בציוד ייעודי הכולל מגברים תוך-תאיים, חיישני כוח ומגברי AC חוץ-תאיים עבור EMG.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית בין קבוצות של מדעי העצבים, פיזיולוגיה ופרמקולוגיה לצורך פרשנות עקבית של הנתונים.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום הטכניקה על זני עכברים שונים או מודלים של מחלות המשפיעים על הגודל או התכונות של היחידה המוטורית.
- מוגבל בשל המורכבות הטכנית של שמירה על יציבות מכנית במהלך הקלטה תוך-תאית בהכנות של בעלי חיים ערים שאינם משושים.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:05
Tracheotomy and Artificial Ventilation
2:51
Placement of the Intravenous Lines
5:07
Dissection of the Hind-limb Muscle and Nerves
7:06
Laminectomy
8:53
Achilles Tendon Dissection
11:03
Results: Simultaneous Intracellular Recording of a Lumber Motoneuron and Force Produced by its Motor Unit
12:51
Conclusion
