המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להקליט פעילות חשמלית מעצבים, שרירים ונוירונים, ואת התנועות התואמות של מנגנון ההאכלה במהלך תוכניות מוטוריות של האכלה. הדבר משיג תחילה על ידי הסרת המסה הבוקאלית (buccal mass) מ-plegia תחת הרדמה, והצמדת אלקטרודות וו לעצבים ולשרירים מרכזיים. השלב השני הוא הנחת המסה הבוקאלית בצלחת הקלטה והכנת הגנגליונים להקלטה חוץ-תאית.

בשלב הבא, מאתרים את הנוירונים המטרה באמצעות אלקטרודות חוץ-תאיות. השלב הסופי הוא השראה והקלטה של תוכניות מוטוריות של האכלה, כגון נשיכה, בליעה ודחייה. בסופו של דבר, תכשיר המסה הבוקאלית התלויה משמש להדגמת הפעילות של עצבים, שרירים ונוירונים בודדים במהלך תנועות האכלה שונות של המסה הבוקאלית.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מחקרי גנגליונים מבודדים, הוא שניתן לקשר ישירות הקלטות מעצבים, שרירים ונוירונים בודדים לתנועות של מנגנון ההאכלה. huu, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלנו, יסייע בהדגמת הפרוצדורה. כדי להתחיל את הפרוצדורה, הרדימו plegia בריא במשקל 200 עד 300 גרם במגש ניתוח על ידי הזרקת כ-50% ממשקל הגוף של מגנזיום כלוריד איזוטוני. לאחר ההזרקה הראשונה ליד זנב בעל החיים, עסו בעדינות את פני השטח של בעל החיים כדי לפרוס את המגנזיום כלוריד.

יש להעניק זריקות נוספות ליד ראש החיה לפי הצורך. לאחר שהחיה מפסיקה להגיב לגירויים מגעים עדינים, יש להקבעה אותה למגש כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה. יש להחדיר סיכה אחת לזנב וסיכה אחת בכל זרוע קדמית.

לאחר מכן, השתמש בפינצטה כדי לצבוט ולהרים את עור בעל החיים במרכז הראש. מאחורי ה-rhino fours בצע חתך קורונלי לרוחב ראש בעל החיים, בדיוק מאחורי הנקודה המוחזקת. לאחר מכן, בצע חתך סגיטלי מרכזי בין ה-rhino fours לכיוון הפה כדי לחשוף את המסה הבוקאלית (buccal mass).

בשלב הבא, הרחיקו את מקרי עור הפנים מהמסה הבוקאלית (buccal mass) וחתכו את העצבים והרקמה החיברית המחוברים לדופן הגוף. כדי להפריד לחלוטין את מקרי עור זה מהמסה הבוקאלית, הקפידו לא לחתוך עצבים או רקמות הפנימיים למסה הבוקאלית. לאחר מכן, תפסו והחזיקו את הוושט.

חתכו את הוושט posterior לנקודה המוחזקת. משכו מעלה את הוושט והרימו את הגוש הבוקאלי (buccal mass) מאחורי הגוש הבוקאלי. הגנגליונים המוחיים, הפלוירליים והפדאליים יוצרים טבעת, כאשר הגנגליון המוחי מחובר לגנגליונים הבוקאליים באמצעות הקשרים המוחיים-בוקאליים (cerebral buccal connectives).

השאירו את הגנגליונים הטבעתיים (ring ganglia) מחוברים למסה הבוקאלית (buccal mass) וחתכו את כל העצבים המוקרנים מגנגליונים אלו לחלקים אחרים של הגוף. לאחר מכן, חתכו את רקמת החיבור סביב המסה הבוקאלית והמשיכו להרים אותה ככל שהיא הופכת לפחות מחוברת לגוף. ברגע שהמסה הבוקאלית מחוברת רק לפה, החזיקו את הוושט ואת המסה הבוקאלית.

בקו ישר. בצעו חיתוך סופי ממש לפני הלסתים כדי לשחרר את המסה הלחית מהגוף. הניחו את המסה הלחית בתמיסה המורכבת מ-50% Magnesium chloride isotonic solution ו-50% SIA saline, כדי לשמור על הרדמה חלקית בזמן חיבור האלקטרודות.

לאחר מכן, העבירו את מסת הפה עם התמיסה לצלוחית פטרי בעלת תחתית קעורה ("cigar bottom"), כאשר החיתוך מבוצע דרך העורק הבוקאלי (buccal artery) בחלק הבטני של מסת הפה. לאחר מכן, הסירו את הגנגליון הפלאורלי והפדאלי על ידי חיתוך קשריהם לגנגליון המוחי. השאירו את הגנגליון המוחי מחובר לגנגליונים הבוקאליים ולמסת הפה באמצעות ה-CBCs, ונתקו קשרים אחרים בין הגנגליון המוחי למסת הפה.

קצץ את הווש ואת בלוטות הרוק לאורכים קצרים. בשלב זה, חבר את אלקטרודות הוו (hook electrodes) לעין של העצב העולרי (ular nerve), לשני עצבי השריר הלחיים שתיים ושלוש, ולענף A של העצב הלחי שני. השתמש בהליך דומה לזה שהודגם בפרסום של JoVE על ידי Collins ו-Shield, וסוכם כאן בקצרה.

עבור כל ניתוק של אלקטרודה, מקמו את האלקטרודה בקרבת העצב או השריר, הניחו את העצב המטרה בתוך הוו והרימו אותו בעדינות באמצעות מניפולטור. לאחר מכן, ייבשו את קטע העצב באמצעות נייר ניגוב מסוג Kim wipe. מרחו טיפה של דבק מהיר מסוג quick gel super glue על העצב שתויה, וודאו שהוו מכוסה לחלוטין בדבק וקצה חוט הייחוס אינו מכוסה בדבק.

בשלב הבא משתמשים במזרק עם צינור פוליאתילן כדי להחיל את התמיסה מהצלוחית על הדבק, פעולה שתגרום למשטח הדבק להתקשות. השלב הבא הוא להכין צלוחית הקלטה עגולה מ-Pyrex במידות של 100 על 50 מילימטר לשימוש כתא הקלטה; מרחים שכבה דקה של גריז ואקום בחריץ שבין התאים המוחים (cerebral) והמקומטים (buckled) בעזרת טיפ פפית כדי למזער דליפות. לאחר מכן, ממלאים את התא הקדמי בתמיסת סליין של Plescia.

העבירו בזהירות את מסת הלחי מתוך פטריית הפטרי לתא הקדמי של כלי ה-Pyrex העגול, וודאו ששום אחת מהאלקטרודות אינה מתוחה מדי, דבר שעלול לגרום לקריעת העצבים. היזהרו מאוד עם אלקטרודות הוו אם יש להעביר את הכלי למיקרוסקופ דיסקציה בינוקולרי אחר. לצורך דילול המעטפת.

קבצו את האלקטרודות בכל צד של המסה הלחית (buccal mass) יחד. אחזו בזהירות באלקטרודות על ידי תפיסת סרט הדבקה של המעבדה המכסה את פיני החיבור, ושוב, ודאו ששום אלקטרודה אינה נמתחת בחוזקה. כאשר הצלחת ממוקמת תחת המיקרוסקופ, האלקטרודות צריכות להיות מונחות בעדינות על דפנות הצלחת ולנוח על הפלטפורמה במהלך הפסקות ובין שלבי הניסוי; אווררו את תמיסת המלח בתא המסה הלחית באמצעות אבן אוורור של אקווריום.

בשלב הבא, תקבעו את הגנגליון המוחי (cerebral ganglion) בתא האחורי, כך שחוטי ה-CBC יעברו דרך החריץ. מרחו גריז ואקום נוסף מעל ה-CBCs. לאחר מכן, הוסיפו תמיסת מלח SIA לשני חלקי הצלחת, כך שהגנגליונים יהיו טבולים לחלוטין.

וודאו שגובה התמיס המלוחי נמוך מגובה גריז הוואקום שבין התא המוחי לתא הפה, כדי למנוע דליפה בין התאים. בשלב זה, מסת הפה צריכה להישען על קרקעית התא הקדמי. לאחר מכן, הצמידו בסיכות את הגנגליונים של הפה על הפלטפורמה המרכזית כדי למנוע פגיעה בעצבים שעדיין מחוברים למסת הפה.

מקמו סיכות על הנרתיק רק בין שני עצבים. לאחר מכן, הוסיפו שתי סיכות נוספות בצדי ה-CBCs כדי למתוח ולעגן אותם. שמרו על הגנגליונים הבוקאליים במצב שטוח או מסובב, בהתאם למיקום הנוירונים המבוקשים.

כדי לסובב את הגנגליון הבוקאלי (buccal ganglion), השתמשו בפינצטה עדינה כדי לתפוס חלק מיותר מהמעטפת של ה-CBC והנעצבו אותו בסיכה בין העצב הבוקאלי השני לעצב הבוקאלי השלישי. כעת ניתן לראות את מרבית גופי התאים הסמוכים לתא האחורי, שגישתם אינה קלה מהחלק העליון של הגנגליון הבוקאלי. לבסוף, הוסיפו שתי סיכות על מעטפת הגנגליון הבוקאלי בצד הסמוך למסה הבוקאלית (buccal mass).

כדי למזער את תנועת הגנגליון הבוקאלי (buccal ganglion), אחזו במעטפת הגנגליון הבוקאלי בקרבת התא האחורי וגזרו את עודפי המעטפת בעזרת מספריים עדינים, מבלי לחשוף את גופי התאים. כדי למזער נזקים, הסירו רק את כמות המעטפת הדרושה כדי לראות את גופי התאים לאחר השלמת הדילול של המעטפת. חברו את כל פיני האלקטרודה לשקעיהם בכבלים המתחברים למגברים.

וודאו שהאלקטרודות אינן מתוחות מדי וש הן מחוברות כראוי לכבלים המתאימים ושהקוטביות נכונה, כדי לשטוף כל שארית של מגנזיום כלוריד. החליפו את תמיסת ה-SIA saline בתא של הגושה הלחיית (buccal mass) בתמיסת SIA saline טרייה. לאחר מכן, השחילו תפר משי דרך הרקמה הרכה בחלק הקדמי של הגושה הלחיית ובצד הגבי (dorsal) לסחוס הלסת.

השתמשו בשתי פיסות של חימר למידול כדי להצמיד את התפר לקצה של הצלחת, ובכך להשעות את המסה הבוקאלית (buccal mass) ממיקומה בקצה הקדמי. השתמשו במניפולטור להחזקת אלקטרודה חוץ-תאית מזכוכית כך שקצה האלקטרודה יהיה קרוב לגנגליון הבוקאלי (buccal ganglion). כדי לאתר ולזהות נוירון, הורידו בעדינות את קצה האלקטרודה החוץ-תאית על המעטפת.

מעל גוף התא (סומה) של הנוירון. יש להחיל זרם ממריץ ולאחר מכן להעביר את הערוץ המשמש לעירור הסומה למצב הקלטה, כדי להקליט את הפעילות באלקטרודה החוץ-תאית ואת הפעילות התואמת בעצבים להשראת דחייה. בדומה לתוכניות מוטוריות, יש להמריץ את עצב הפה (buccal nerve) 2A באמצעות רכבת ארוכה של פולסים בבתדירות של 2 Hz ובמשך 1 ms, כדי ליצור דפוסי EES.

הדפוסים נמשכים לאורך תקופת הגירוי ועשויים להימשך עד זמן קצר לאחר סיום הגירוי. כדי להשרות תוכניות מוטוריות דמויות נשיכה, הנח מספר גבישים של caracol מוצק ישירות על הגנגליון המוחי.

דפוסים חזרתיים מתחילים בדרך כלל בתוך חמש דקות ונמשכים בערך 10 עד 15 דקות לפני שהם מתחילים להיחלש כדי להשרות בליעה. בדומה לתוכניות מוטוריות, יש להפעיל caracol ולהמתין עד שהמסה הבוקאלית תייצר נשיכות חזקות. לאחר מכן, במהלך נשיכה, יש להניח פס של אצות בפי החיה כך שהיא תתפוס את האצות.

כאן מוצגים הגירוי וההקלטה של הנוירון המוטורי B nine שזוהה, וההקלטה מאותו נוירון, משריר ה-I two וממספר עצבים במהלך תוכניות מוטוריות של האכלה. כאן מוצגות תמונות הווידאו שנלקחו מאותה סדרה של תוכניות מוטוריות. דפוסי בליעה הושרכו על ידי יישום של carbahol לגנגליון המוחי והנחה עוקבת של רצועת אצה לתוך התופס (grasper) במהלך נשיכה המושרה על ידי carbahol.

בתמונה זו, הרגוליה (ragula) מושלכת קדימה כדי לתפוס את האצה, ובתמונה זו, הרגוליה נסוגה פנימה תוך משיכת האצה אל תוך הפה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו יש להכין את דגם מסת הפה התלויה, ולהשיג הקלטות של תוכניות המוטוריקה של ההזנה in vitro.