Antigen המלאכותי הצגת תא הפעלה (aAPC) מתווכות והרחבת תאי T קטלניים טבעיים

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לייצר תאי תצוגת אנטיגן מלאכותיים (AAPC) המבוססים על CD1D לצורך הרחבה של תאי NK T. הדבר מבוצע תחילה על ידי הוספת חלבונים לפונקציונליזציה של החרו지를 המגנטיים. בשלב השני, אושרית אוכלוסיית תאי ה-NK T הראשונית מדם פריפריאלי.

בשלב הבא, תאי ה-T המועשרים ננותחים בתרבית משותפת (co-culture) עם ה-A A PC. בשלב הסופי, מוערכים הפנוטיפ והתפקוד של אוכלוסיית תאי ה-A A PC. לבסוף, ניתן לקבוע את טהרת תתי-אוכלוסיות תאי ה-T שהורחבו באמצעות ניתוח ציטומטרי זורם (flow cytometric analysis). היתרון העיקרי של APCs על פני שיטות נוכחיות המשתמשות בתאים דנדריטיים הוא שבתאים דנדריטיים עלולה להיות שונות גבוהה בין תורמים.

תאי APCs מספקים שיטה סטנדרטית, ניתנת לשחזור וזמינה לשימוש מיידי להרחבה של תאי NK T. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר עבדתי עם ד"ר Schneck וצוותו ב-Johns Hopkins. הם היו חלוצים בתחום השימוש בקומפלקסים מלאכותיים מציגי אנטיגן לצורך הרחבה של תתי-אוכלוסיות קלאסיות של תאי CD eight T.

את הפרוצדורה ידגימו ד"ר James East, עמית פוסט-דוקטורט, ובנו של ד"ר Wendy, עמית מחקר מהמעבדה שלי. התחילו בהעברה של 1 mL של חרוזי dyna bead M four 50 epoxy אל תוך מבחנה הברגית של זכוכית בורוסיליקט שקופה בנפח 5 mL. לאחר מכן, שטפו את החרוזים עם 3 mL של בופר bore eight סטרילי בתוך מבחנה נפרדת למיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 mL.

הוסף 100 µg של human CD 1D IG dimer, ו-20 µg של המולקולות הקו-סטימולטוריות הרצויות ל-1 mL של PBS נטול סידן ומגנזיום. לאחר מכן, הנח את הבקבוקון הזכוכית המכיל את החרוזים על מגנט ושאב את בופר הבוראט. לאחר מכן, הוסף את תערובת החלבונים לבקבוקון הזכוכית והחזר את הפקק.

ערבבו את התמיסה מיד על ידי היפוך של הבקבוק, לאחר מכן כסו את הפקק בפרפילם והניחו אותו על רוטטור למשך הלילה בטמפרטורה של 4 °C. למחרת, הניחו את הבקבוק מזכוכית על המגנט שוב והוציאו את תערובת החלבונים תוך הימנעות זהירה מהחרו지를. שטפו את החרו지를 שלוש פעמים על ידי הוספת 3 mL של בופר לשטיפת חרוזים ודגירה שלהם על הרוטטור בטמפרטורה של 4 °C למשך חמש דקות.

כדי לאשש שהחלבונים נטענו באופן יציב על החרוצים, צבעו מנה (aliquot) של החרוצים באמצעות נוגדנים ונתחו אותם באמצעות אנליזה של ציטומטריית זרימה. כעת, העבירו 5×10⁷ חרוצים למבחנה זכוכית קטנה של 1.5 milliliter ושטפו את החרוצים ב-1 milliliter של PBS סטרילי. לאחר מכן, המתינו 48 עד 72 שעות לפני השימוש.

טען את החרוזיים השטופים באנטיגן במיליליטר אחד של PBS סטרילי בזמן טעינת החרוזיים באנטיגן. אסוף את ה-PBMC על ידי דילול ראשוני של דם התור המהפרין עם נפח שווה של PBS בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסף 15 מיליליטר של PHI בטמפרטורת החדר למבחנות קוניות של 50 מיליליטר, והשכב באיטיות 25 מיליליטר של תערובת הדם המדוללת מעל ה-phi.

לאחר מכן, סנטריפוגו את הדגימות למשך 30 דקות ב-700 ×g ובטמפרטורת החדר, כאשר הבלם (break) כבוי. השתמשו בפיפט פסטור כדי להעביר בזהירות את שכבת הממשק של הלימפוציטים לשפופרת קונית חדשה של 50 מיליליטר. לאחר מכן, שטפו את הלימפוציטים ב-50 מיליליטר של PBS, השליכו את העלייה (supernatant) ואחדו את השפופרות מאותו תורם לשפופרת אחת.

לאחר שטיפה נוספת של ה-PBMC ב-20 milliliters של PBS, ספרו את התאים ולאחר מכן השעיו אותם בריכוז של 5 × 10⁷ תאים ל-milliliter ב-max buffer. כדי לבודד את פראקציית תאי ה-T, דגרו 100 microliters של תמיסת העשרה של תאי PAN T מתוך ערכת העשרת תאי T אנושיים של EP עם שני milliliters של PBMC למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, דגרו את התמיסה עם 100 microliters של חרוזי מגנט בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות נוספות.

השלם את הנפח הסופי של הממס ל-2.5 milliliters ולאחר מכן הנח את המבחנה במגנט. לאחר חמש דקות, שפוך במהירות את הפראקציה החיובית CD three למבחנה קונית של 15 milliliters. כעת שטוף את התאים ב-5 milliliters של max buffer קר, וספור את התאים החיוניים.

הסיר אליקוט לצביעה לצורך אימות כדי לבחור תחילה את התאים החיוביים ל-CD 1 61. השהה מחדש את תאי ה-T המועשרים ב-980 microliters של max buffer קר בקרח, ולאחר מכן דגור את התאים ב-10 micrograms של נוגדן מונוקלונלי anti CD 1 61 למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע degrees Celsius. לאחר שטיפת התאים, השהה מחדש את המשקע ב-800 microliters של max buffer וב-200 microliters של anti-US IgG one microbeads.

דגרו תמיסה זו בטמפרטורה של 4 °C למשך 10 דקות נוספות. בזמן שהתאים מדגרים עם המיקרו-בידס (microbeads), הוסיפו 3 mL של Max Buffer כדי להש equilibration של עמודת LS. לאחר שטיפת פראקציית תאים זו, העבירו בפיפטת בזהירות את התאים ב-3 mL של Max Buffer אל תוך העמודה.

כעת שטפו את העמודה שלוש פעמים עם 3 mL של max buffer טרי. לאחר מכן, הוסיפו 3 mL נוספים של max buffer טרי לעמודה והעבירו את העמודה למבחנה קונית של 15 mL. הוציאו את תאי ה-CD161 positive CD3 positive המטוהרים, ולאחר מכן ספרו את הפרק המועשר בתאי NKT.

התחילו שלב זה על ידי תרבית משותפת (co-culture) של 10⁶ תאי T מועשרים CD161+ CD3+ ו-10⁶ תאי APC ב-16 מיליליטר של מצע מלא. העבירו 160 µL מהתרבית המשותפת לכל באר בלוח 96 באערים מסוג polystyrene עם תחתית בצורת U שעבר טיפול לתרביות רקמה, עם מכסה למניעת אידוי. ביום 12 עד 14, קצרו את התאים וספרו אותם. נתחו את האוכלוסיות באמצעות ניתוח ציטומטריה זרימה, לאחר מכן חזרו על התהליך ועל התרבית המשותפת.

את תאי ה-NKT שהורחבו, כפי שהודגם זה עתה, ניתן להקפיא לאחר סבב ההרחבה השני. כדי לבחון את התפקוד של תאי ה-AAPC, יש לבצע תחילה תרבית משותפת של 5×10⁴ תאי NKT לבאר עם 5×10⁵ תאי AAPC בנפח סופי של 200 µL של מצע גידול מלא בלוחית 96 בארות בעלת תחתית בצורת U. לאחר 24 עד 48 שעות, יש לאסוף את עליית התרבית (supernatant) לצורך אנליזה באמצעות ELISA. איור זה מדגים כי חלבוני ה-CD1D IG מקובעים באופן יציב על פני השטח של החרוזיים המגנטיים, כפי שמוצג כאן.

נוגדני CD1d ו-anti-CD28 מובעים שניהם על פני השטח של החרוזים המגנטיים, כפי שמוצג בגרף זה. היברידומת תאי NK T של עכבר חיובית ל-Vα14, מסוג DN30 2D3, גודלה בתרבית משותפת עם AAPCs שאינם טעונים באנטיגן alpha-gal soluble או עם AAPCs טעונים ב-alpha-gal. לאחר מכן נאספו על-הספיגנאט של התרבית, וייצור IL-2 נמדד באמצעות ELISA, מה שסיפק שיטה פשוטה לבדיקת כל מנה של תאים מציגי אנטיגן. בניסוי זה, תאי T מדם פריפריאלי אנושיים חיוביים ל-CD161 וחיוביים ל-CD3 הועשרו באמצעות הפרדה בחרוזים מגנטיים.

לאחר מכן, התאים עברו גרייה פעם בשבוע למשך 14 ימים באמצעות A A PC הטעון alpha galera, ונבדקו להבעה של V alpha 24 ו-V beta 11. באופן משמעותי, נמצא שגם עם אוכלוסיית תאי NKT ראשונית נמוכה יחסית של 0.03%, ניתן היה להרחיב את התאים לאוכלוסייה של כ-67% חיובית ל-V alpha 24 וחיובית ל-V beta 11. כאן, תאי C one R CD 1D דגרו עם תאי NKT ביחסים המצוינים, בנוכחות או בהיעדר אנטיגן Alpha Gal SER, בלוחות 96 בארות מסוג U bottom למשך 20 עד 24 שעות.

ליזיס של תאי לימפומה מסוג B בתיווך תאי NKT נבדק לאחר מכן באמצעות בדיקת שחרור כרומיום. תאי NKT שהורחבו ב-PC היו מסוגלים לבצע ליזיס של קו תאי לימפומה זה. בנוכחות או בהיעדר alpha galera, תאי NKT הורחבו מ-PBMC של מתנדבים בריאים ומחולי סרטן, והועמסו ב-alpha galera.

מחשב PC הצליח להרחיב את אוכלוסיות תאי ה-NKT משתי הקבוצות. כאשר משתמשים באוכלוסייה התחלתית של 2 מיליון תאי T חיוביים ל-CD 1 61 וחיוביים ל-CD three, ניתן להשיג יותר מ-10 to the seventh תאים לאחר שני סבבי הרחבה. ניתן להשתמש בתאי NKT מורחבים למחקרים פונקציונליים, כפי שמוצג כאן.

תאי ה-NKT שהורחבו ex vivo נותרים קשובים לגירוי על ידי Alpha GAL והם יצרנים חזקים של IL 17 A, TNF alpha ואינטרפרון גמא. יש לציין כי אם אוכלוסיית העשירה הראשונית של תאי T נמוכה ולא ניתן לבצע את שלב ההעשרה השני של CD 1 61, ההרחבה המתווכת על ידי A A PC עשויה שלא להניב את התוצאות המצופות. עם זאת, אם אחוז תאי ה-NKT במחזור הדם גבוה מ-0.1%, עדיין ניתן יהיה להשיג הרחבה משמעותית של תאי NKT invariant.

בסיכומה של הדברים, נתונים אלו מדגימים כי ניתן להשתמש ב-A A PC מבוסס CD 1D כדי להרחיב ולגרות ביעילות תאי NK T אנושיים ראשוניים לאחר הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון QPCR, כדי להשיב על שאלות נוספות, כגון מהי קינטיקת ההפעלה של תאי NK T לאחר פיתוחם. טכניקה זו סוללת את הדרך עבור חוקרים בתחום ההפטולוגיה לבחון את תפקידם של תאי NKT במחלת הכבד השומני.