ייצור והשימוש פיגי גב Multibarrel אלקטרודות ל
18 בינואר 2013
Iontophoresis של אגוניסטים ואנטגוניסטים עצביים במהלך תאי In vivo הקלטות הן דרך רבה עצמה כדי לתפעל microenvironment של תא עצב. מניפולציות אלו בקלות ניתן לעשות זאת באמצעות קופת חיסכון, גב multibarrel אלקטרודות. כאן אנו מתארים כיצד לייצר אותם ולהשתמש בם במהלך הקלטות קוליות.
נוהל זה נועד ליישום יוני-אפורטי של חומרים פרמקולוגיים למעגלים מיקרוסקופיים במוח, תוך הקלטה סימולטנית של פעילות עצבית. ראשית, משוךת אלקטרודת זכוכית בעלת חלול אחת להקלטה של תא בודד וכפף את הקצה שלה. כמו כן, משוך אלקטרודת זכוכית רב-חלולית ושבור את קצהה לקוטר הרצוי.
המשיכו להרכבת שתי האלקטרודות. בסופו של דבר, האלקטרודה המיוצרת משמשת להקלטות חוץ-תאיות in vivo, שבהן ניתן להחדיר סוכנים פרמקולוגיים לפי הצורך כדי להשפיע על מיקרו-מעגלים עצביים. שלום, שמי ד"ר Achim Klu, והמעבדה שלנו תראה לכם היום כיצד לייצר אלקטרודות רב-חביתיות מסוג piggyback.
ניתן להשתמש באלקטרודות אלו כדי להעביר באמצעות אינופור (ionophore) אגוניסטים ואנטגוניסטים עצביים אל המיקרו-סביבה של נוירון, ובכך להפעיל מניפולציה על מעגלים עצביים של נוירון in vivo. שלום, אני ד"ר An Zillow. אני פוסט-דוקטורנט במעבדתו של ד"ר Ah him Crow, והיום אדגים את ההליך. עבור אלקטרודה בעלת חבית אחת, השתמשו בקפילרה מזכוכית בעלת חבית אחת עם פילמנט, ומשכו את הקצה עד לקבלת קוטר של כ-1 עד 2 µm ואורך מוט של 10 עד 12 mm.
יש לאמת את ההתנגדות של האלקטרודות שנמשכו מדי פעם על ידי מילואן בנתרן כלורי בריכוז three molar ובדיקתן באמצעות מד Ω סטנדרטי ב-0.9%saline. לאחר מילוי האלקטרודה בתמיסת מלח, התמיסה מתייבשת במהירות, מה שהופך את האלקטרודה לבלתי שמישה. לכן, יש לבצע בדיקה זו בלבד.
בצעו משיכה למספר אלקטרודות שלא ישמשו לייצור ה-piggyback. כדי ליצור אלקטרודה רב-חולית מלאה, משכו את הזכוכית עד לקבלת קצה פיפטה בקוטר כולל של כ-10 micrometers או פחות. אלקטרודה בעלת קצה שנמשך כראוי היא קריטית להצלחת התהליך.
בנוסף להיותה ארוכה ודקה, הקצה חייב להישאר קשיח על מנת שניתן יהיה לשבור אותו בקלות לקוטר הקצה הרצוי. שבירת הקצה לקוטר הנכון תתבצע בשלב הבא. לכן, גודל הקצה המדויק הוא פחות קריטי במהלך תהליך האיחוד (pooling) מאשר הצורה הכללית של קצה האלקטרודה, שצריכה להיות ארוכה ודקה יחסית.
כעת, החזיקו את האלקטרודה בעלת החלולเดียว בזווית של כ-45 מעלות, כאשר הקצה פונה כלפי מטה, והעבירו אותה דרך הלהבה במהירות יחסית. שאפו שהלהבה תמיס את הזכוכית באזור המעבר, במרחק של כ-10 מילימטרים מקצה האלקטרודה, כדי לכופף אותה בזווית של כ-20 מעלות. הניחו את האלקטרודה בעלת החלולים המרובים על מצע של חימר לפיסול על גבי תבנית זכוכית, ולאחר מכן הכניסו אותה לבמות המיקרוסקופ.
מחזיק שקופיות באמצעות מניפולטורי ה-XY של במה המיקרוסקופ, הזרקו בעדינות את קצה האלקטרודה כנגד פיסת הפלקסיגלס. עקבו אחר שבירת הקצה דרך העיניות של המיקרוסקופ. הגדרת הרכבת האלקטרודה מוצגת כאן.
האלקטרודה רב-חביתית מוחזקת על גבי סלייד זכוכית על שולחן המיקרוסקופ. האלקטרודה בעלת החבית הבודדת מוחזקת על ידי מניפולטור ידני רב-צירי המאפשר למשתמש להוריד את הפ pipette בעלת החבית הבודדת על הפ pipette רב-החביתית בדיוק רב. יש להוריד את האלקטרודה בעלת החבית הבודדת ישירות לתוך החריץ של האלקטרודה רב-החביתית שנוצר על ידי סידור חמש החביות, כך שהקצה שלה בולט מעבר לקצה של האלקטרודה רב-החביתית בכ-5 עד 10 micrometers.
הדביקו את מוטות שתי האלקטרודות זו לזו באמצעות ציאנואקרילט. התחילו במיקום המרוחק ביותר מהקצוות והניעו לאט קיסם עם טיפת דבק לאורך מוטות האלקטרודות לכיוון קצותיהן. מריחת דבק קרוב מדי לקצות האלקטרודות תסתימה אותן ותהפוך את האלקטרודה לבלתי תפקודית, לפחות באופן חלקי.
ערבבו כמות קטנה של צמנט דנטלי. המתינו כ-15 דקות לייבוש. לאחר מכן, הסירו בזהירות את אלקטרודת ה-piggyback המושלמת.
ראשית, נתק מהמחזיק של המיקרו-מניפולטור, ולאחר מכן נתק מהלביה הזכוכיתית. ממש לפני השימוש באלקטרודה, הכן למילוי חוזר (backfill) של כל חבית בתרופה המתאימה לה. מלא את ארבע החביות החיצוניות של תצורת חמש החביות בארבע התרופות הנבחרות, ואת החבית המרכזית בתמיסת sodium chloride בריכוז 3M כחבית איזון.
לאחר מכן, מלאו את אלקטרודת ההקלטה בעלת החלול הבודד בנתרן כלורי בריכוז three molar. כעת הפעילו את מודולי משאבת האיון-פרזיס ובחנו את כל החלולים. פונקציית בדיקת האלקטרודה של כל מודול משאבה תסייע לקבוע אם חלול האלקטרודה תקין עבור הקלטות מעומק המוח.
אלקטרודה חומש-חביתית גמורה, שהורכבה יחד עם אלקטרודת רישום חד-חביתית, בעלת מוט ארוך של כ-7 מילימטרים. אגוניסטים ואנטגוניסטים סינפטיים שונים משמשים בדרך כלל לאיונטופורזה לצורך חסימת עיכוב גליצין באמצעות תרופות כגון אנטגוניסטים לקולטן הגליצין. Trick nine hydrochloride מגביר בדרך כלל את הפעילות החשמלית בנוירונים.
נתוני דגימה אלו מודדים פונקציה של קצב פריקה של נוירונים שמיעתיים לעומת עוצמה, ומראים תגובות לגירויי קול סינוסואידליים בעוצמה עולה שהועברו לאוזני בעל החיים. צלילים חזקים יותר הובילו לקצבי ספייקים גבוהים יותר לפני יישום strict nine. פונקציית קצב-העוצמה של הנוירונים מראה קצבי ספייקים נמוכים.
החלת זרם יונטופורזה ראשוני של 15 nano amps מעוררת עלייה קלה בזרם הפליטה. זרמי פליטה גבוהים יותר באופן הדרגתי חוסמים יותר ויותר קולטני גליצין בנוירון, מה שמוביל לקצבי פריקה גבוהים יותר באופן הדרגתי. בזרם של 45 nano amps, נראה כי כל קולטני הגליצין של אותו נוירון נחסמים על ידי strychnine hydrochloride.
כל עלייה נוספת בזרם הפליטה ושחרור כמות גדולה יותר של התרופה לא הובילו לשינוי נוסף. פונקציית רמת קצב הפריקה של הנוירונים לאחר סיום האיונטופורזה, התאוששות מלאה של התגובות העצביות חזרה לרמת הבסיס מתרחשת לאחר כ-25 דקות. תהליך התאוששות זה תלוי בסוג ובכמות התרופה שנפלטה.
חשוב לזכור כי התרופה תפעפף לסביבת אתר ההקלטה ועשויה לחסום רצפטורים גם בנוירונים סמוכים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לשלב אלקטרודת הקלטה עם אלקטרודת תרופות רב-חביתית כדי להשיג הקלטות עמוקות מהמוח ברמת רעש נמוכה, יחד עם הזרקה מבוקרת בזמן של עד ארבעה סוכנים פרמקולוגיים.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר את תהליך הייצור והשימוש באלקטרודות רב-חוליות מסוג piggy-back עבור יונטופורזה של אגוניסטים ואנטגוניסטים עצביים במהלך הקלטות in vivo. אלקטרודות אלו מאפשרות מניפולציה של המיקרו-סביבה של נוירון תוך כדי הקלטת פעילות עצבית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- מניפולציה של מעגלים עצביים
רקע
- יונטופורזה (Iontophoresis) היא טכניקה המשמשת להחדרת חומרים פרמקולוגיים למעגלים מיקרו-מוחיים ספציפיים.
- הקלטות חוץ-תאיות in vivo הן חיוניות לחקר פעילות עצבית.
- שילוב של יישום תרופות עם הקלטות עצביות משפר את הדיוק הניסויי.
- אלקטרודות רב-חביתיות (Multibarrel electrodes) מאפשרות הולכת תרופות והקלטה בו-זמנית.
מטרת המחקר
- להדגמת תהליך הייצור של אלקטרודות רב-חוריות מסוג piggy-back.
- להדגמת היישום של אלקטרודות אלו בהקלטות עצביות שמיעתיות.
- למתן תובנות לגבי מניפולציה של מעגלים עצביים in vivo.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מתיחת אלקטרודות זכוכית בעלות חלול אחד או מספר חלולים לממדים ספציפיים.
- הרכבת האלקטרודות בדיוק גבוה באמצעות מיקרוסקופ.
- מילוי חוזר של החלוליות בחומרים פרמקולוגיים לצורך יונטופורזה.
- בדיקת התקינות התפקודית של האלקטרודות לפני השימוש.
תוצאות עיקריות
- האלקטרודות שהורכבו העבירו בהצלחה סוכנים פרמקולוגיים לצורך מניפולציה של הפעילות העצבית.
- יישום של אנטגוניסטים לקולטני גליצין העלה את קצבי הפריקה העצבית.
- התאוששות של התגובות העצביות התרחשה לאחר סיום האיונטופורזה.
- הנתונים הדגימו את יעילות הטכניקה בהקלטות של נוירונים שמיעתיים.
מסקנות
- אלקטרודות רב-חוריות מסוג Piggy-back יעילות להגשה משולבת של תרופות ולהקלטה עצבית.
- שיטה זו מאפשרת מניפולציה מדויקת של מעגלים עצביים in vivo.
- הטכניקה יכולה לשפר את ההבנה של הדינמיקה העצבית בתגובה לחומרים פרמקולוגיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת מניפולציה מדויקת והפיכה של קלטים סינפטיים in vivo, ובכך תומכת בתיקוף של מטרות (target validation) באמצעות בידוד של מסלולים עצביים ספציפיים. היא מגבירה את הביטחון החזוי במודלים פרה-קליניים על ידי מתן אפשרות לחקירה פרמקולוגית של תפקוד המעגל תחת בקרה של זמן. גישה זו מסייעת בהפחתת סיכונים מכניסטיים (mechanistic de-risking) בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי קישור בין מטרות מולקולריות לבין תפוקות פיזיולוגיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשרת בדיקת השערות לגבי תת-סוגים ספציפיים של רצפטורים באמצעות חסימה או הפעלה סלקטיבית של קלטים סינפטיים.
- ערך תפעולי: מספקת בקרה הפיכה ותלויית-מינון על מערכות מוליכים עצביים להערכת המעורבות של המטרה.
- ערך ניבוי: תומכת בביטחון במטרה על ידי הדגמת ההשלכות התפקודיות של מודולציה של רצפטורים על פריקה עצבית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר קריאות כמותיות בזמן אמת של פעילות נוירונלית בתגובה לסוכנים פרמקולוגיים.
- ערך תפעולי: מאפשר מינון יונטופורי סטנדרטי וניתן לשחזור לאורך מפגשים ניסויים.
- מוכנות הבדיקה: מקל על סריקת אגוניסטים ואנטגוניסטים עם בקרה זמנית מדויקת למחקרי מנגנוני פעולה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מגשר בין ממצאים של מטרות in vitro לבין תגובות פיזיולוגיות in vivo במעגלים עצביים שלמים.
- מערכת רלוונטית למחלה: תומכת בהערכת השפעות תרופתיות במודלים רלוונטיים מבחינה התנהגותית, כגון מסלולי עיבוד שמיעתי.
- הפחתת סיכונים מנגנונית: מבהירה האם השפעות התנהגותיות שנצפו נובעות ממודולציה ישירה של המטרה לעומת פיצוי ברמת הרשת.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי מתן אפשרות לתיקוף פונקציונלי של מטרות לפני אופטימיזציה של המוליכים, במיוחד בתוכניות המתמקדות במדעי העצבים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בהבהרת מסלולים על ידי בידוד תרומות של קלטים אפרנטיים ספציפיים לפלט עצבי.
- סריקה: מספק תוצאות אלקטרופיזיולוגיות כמותיות המאפשרות להסיק על סלקטיביות ועוצמה של תרכובות.
- אנליטיקה: מספק קשרי זרם-מינון יונטופוריים המתואמים עם תפוסת רצפטורים והשפעה פונקציונלית.
- מחקר תרגומי: מקשר בין מניפולציה מולקולרית לשינויים באותות עצביים הרלוונטיים לנקודות קצה של עיבוד חושי.
- שימוש חוזר ארגוני: עיצוב האלקטרודות מאפשר שימוש חוזר באזורי מוח שונים ובמועמדים לתרופות שונים עם מינימום של תיקוף מחדש.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בתיקוף המטרה על ידי מתן אפשרות לחקירה סיבתית של קלטים סינפטיים.
- ערך תפעולי: מבטיח הקלטות יציבות עם רעש נמוך בשילוב עם הולחה מדויקת של תרופות לקבלת תוצאות הדירות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי אישור מעורבות המטרה ברמת המעגל העצבי לפני מחקרים הדורשים משאבים רבים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של תרכובות בהתבסס על השפעות עצביות תפקודיות in vivo.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרו-כירורגיה, במשיכת אלקטרודות ובטכניקות של יונטופורזה.
- תלוי במיקרוסקופיה מדויקת ובמניפולטורים לצורך יישור אלקטרודות ברמה של סוב-מיקרון.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי מילוי חוזר (backfilling) וייבוש כדי למנוע סתימה של הקצה.
- כולל כיול של זרמי הפליטה להשגת רמות החסימה הרצויות של הרצפטורים.
- מוגבל על ידי השפעות דיפוזיה של התרופה העלולות להשפיע על נוירונים שכנים, דבר הדורש פרשנות זהירה.
