בידוד, אפיון והשוואתי התמיינות של תאי גזע אנושיים שיניים זולות נגזרה שיניים קבועות על ידי שימוש בשתי שיטות שונות

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד, לאפיין ולהבדיל תאי גזע של פולפה שנונית אנושית משיניים קבועות באמצעות שתי שיטות. דבר זה מושג על ידי איסוף שיני בינה בריאות שאינן בוקעות, וחיתוכן סביב נקודת המפגש בין המנץ לזגוגית בתחילת התהליך. תאי גזע של פולפה שנונית D PSCs מבודדים באמצעות שתי שיטות שונות.

בשיטה הראשונה, רקמות פוליפים מעובדניות אנזימטית על ידי דגירה ב-collagenase type one בתוספת תמיסת מרווח בין-דיסקי. אנו מכנים אותן כאן ed. לעומת שיטת הבידוד בשיטה השנייה, רקמות פוליפים מוכנסות לבקבוק ללא כל עיבוד אנזימטי.

בדרך זו, תאי dpss מתחילים לנדוד מהרקמה אל תוך הבקבוקה. תאים אלו, המכונים OG, מתייחסים לשיטת בידוד באמצעות צמיחה החוצה (outgrowth isolation). השלב השני של הפרוצדורה הוא זיהוי תאי הגזע באמצעות ציטומטריה של זרימה.

השלב השלישי של הפרוצדורה הוא השראת התמיינות של אודונטובלסטים, והשלב הסופי של הפרוצדורה הוא הערכה השוואית של התמיינות אודונטובלסטים בין שתי קבוצות באמצעות צביעה באדום ו-QBCR. אני RA Kde מהמחלקה לתאי גזע וביולוגיה התפתחותית במכון Rian. היום אדגים לכם את הבידוד, האפיון וההתמיינות ההשוואית של תאי גזע מזנכימליים אנושיים באמצעות שתי שיטות.

שלום, אני ד"ר רזאיאן ממכון ריו. אנו עובדים על פרויקט הקשור לתאי גזע של מוך השן האנושי. תאים אלו הם סוג של תאי גזע מזנכימליים, אותם ניתן להשיג בקלות עם מינימום כאב ותחלואה.

תאי גזע מסוג Mechy מאופיינים ביכולת התרחבות פלסטית, ביצירת מושבות וביכולת גזירה מרובה. שלום, אני ד"ר Ami מהמחלקה לתאי גזע. במכון, אנו משתמשים בנוהל זה במעבדה שלנו כדי לבודד תאי גזע לצורך מחקרי הגבלה ויישומים עתידיים.

ברפואה רגנרטיבית, השלב הראשון לשימוש במקור זה של תאי גזע עבור טיפולים עתידיים מבוססי תאי גזע הוא בחירת הפרוטוקול המיטבי לבידוד תאי גזע מרקמה אנושית. כדי להשיג מטרה זו, חיוני לבחון היבטים מסוימים של התנהגות תאית תחת תנאים שונים של בידוד תאי גזע. ראשית, אבצע בידוד של תאי גזע מפולפה דנטלית אנושית באמצעות דיסוציאציה אנזימטית של הפולפה או על ידי צמיחה של תאי גזע מתוך שתלי רקמה.

לאחר מכן אבצע אפיון והבחנה ביניהם לבין נפיחות של אוגן. אם כך, נתחיל. ראשית, שקלו פפסין וקולגנאז Type one, והמיסו את שניהם ב-PBS.

לאחר מכן, סננו אותם באמצעות מסנן מזרקה של 0.2 micron. העבירו את שניהם למבחנה קונית. לאחר מכן, הוסיפו pener ו-PBS כדי להגיע לריכוז הסופי.

העבירו שיניים בינה בריאות למעבדה בתוך תווך בסיסי קר בתנאי פלדה. נקו את פני השן באמצעות 70% ethanol לפני הבדיקה. ודאו כי כל השאריות פונו מפני השן.

חתכו את השן מסביב לחיבור בין השמחה לזגוגית (cement enamel junction) באמצעות דיסק דנטלי סטרילי כדי לחשוף את תא הפולפה. יש לתחשב בכך שפעולת החיתוך חייבת להתבצע באיטיות כדי להפחית התחממות יתר של הרקמה הדנטלית. לאחר מכן, הפרד בעדינות את רקמת הפולפה מהכתר, כלומר חתוך את רקמת הפולפה לחתיכות של 1-2 מילימטר באמצעות להב סקארפה (Scarpa blade).

העבירו חתיכות קטנות של רקמת מוך לתוך 1 mL של תמיסת אנזים למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 °C, תוך ביצוע ערבוב ב-vortex בכל 30 דקות כדי לסייע בפירוק רקמות המוך. לאחר מכן, הסירו צבירים גדולים על ידי סינון דרך נפה לתאים של 70 micron. לאחר מכן, הוסיפו PBS המכיל PENER וסבבו בצנטריפוגה במהירות של 1,200 RPM למשך חמש דקות.

הסיר את העל-נוזל (supernatant) בזהירות. לאחר מכן, השהה את הפלטה במצע הפרליפרציה (proliferation medium), העבר אותה לבקבוק תרבית והוסף מצע. לאחר מכן,K דגרה את הדגימות.

החליפו את המצע בכל שלושה ימים עד להשגת התלכדות (confluence) של התאים עבור שיטת העבודה. חזרו על תהליך החיתוך. חיתוך השן פירושו פירוק הרקמות לfragments בגודל של 1 עד 2 מילימטר.

לאחר מכן, העבירו אותם לתרבית. שטפו עם מצע הגדלה (proliferation medium) והדרימו. יש להקפיד שנפח כולל של מצע ההגדלה יספיק לתמיכה בהיצמדות של כל החלקים לצורך צמיחה עתידית של התאים.

יש להחליף את המצע לאחר שצפית לצמיחה, ולאחר מכן מדי שלושה ימים עד להשגת התלכדות תאים (confluence). לצורך אימונופנוטיפ, דגרו את שני סוגי ה-D PSCs עם נוגדנים המשולבים עם PE או FITC למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס בחושך. לאחר מכן, הוסיפו PBS וסובבו בצנטריפוגה במהירות של 1,200 RPM למשך חמש דקות.

הסר את הנוזל העליון ותלה שוב את התאים; השהה את הפלטה ב-PBS ובסוף הערך סממנים פני השטח באמצעות ציטומטר זרימה, עבור שני סוגי ה-DPCs למשך שלושה מעברים. לאחר מכן, השתמש בטריפסין בקרח והעבר אותם לשש צלחות תרבית אדומות בצפיפות של 60% והחלף את ה-PM במצע אודונטוגני. שלושה בארות יישארו כביקורת שלילית על ידי הוספת pm.

יש להחליף את המצע מדי שלושה ימים. ביום ה-21 יש לשטוף את התאים עם PBS. לאחר מכן, יש לקבע אותם באמצעות מיליליטר אחד לבאר של 10% formal gel height למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר 15 דקות, הסירו בזהירות את המקבע ושטפו את התאים שלוש פעמים במים מזוקקים. לאחר מכן, החליפו את המים במיליליטר אחד של תמיסת צבע אלקאזא אדום (red alza). לאחר 20 דקות, הסירו את עודפי הצבע ושטפו את התאים ארבע פעמים במים דה-יוניים.

לאחר מכן, הוסיפו 1 מיליליטר מים לכל באער כדי למנוע את התייבשות התאים. לאחר הצביעה, ניתן לראות תחת המיקרוסקופ שלושה מסלולים העוברים לצבע אדום בהשוואה לבקרות; ניתן לראות בהגדלה גבוהה ספיגת צבע של הצביעה מסביב לתא לצורך כימות הצביעה האדומה. לאחר הסרת המים, הוסיפו 1 מיליליטר לכל באער של 10% חומצה אצטית, ולאחר מכן דגרו למשך 30 דקות תוך כדי ניעור.

לאחר מכן, גרדו בעדינות את התאים מהפלטה באמצעות גורד תאים. העבירו אותם למבחנות נפרדות. ערבבו בעוצמה (VOR) למשך 30 שניות.

לאחר מכן, חמם אותם ל-85 °C למשך 10 דקות. כדי למנוע התאיידות, אטום את המבחנות עם ParaView והעבר אותן לקרח למשך חמש דקות, לאחר מכן סנטריפוג אותן ב-20,000 G למשך 15 דקות. במקביל, הכן סדרת דלחירי סטנדרט של Alzheimer red בהתאם לפרוטוקול הרלוונטי.

לאחר הסתירגציה, הוצא את ה-snat והעבר אותם למבחנות חדשות. נטרל את ה-pH באמצעות 10% ammonium hydrocyte. לאחר מכן, הוסף תמיסות סטנדרט וכן דגימות לפלטת 96.

העבירו לפלטת בארות ולאחר מכן מדדו את הבליעה באורך גל של 405 nanometer ונתחו את הנתונים בהתאם לדילול סדרתי סטנדרטי. כאן ניתן לראות DPCs, אשר בודדו על ידי דיסוציאציה אנזימטית ביום ה-10, ה-15 וה-18, וכן outgrown DPCs ביום ה-5, ה-10, ה-13 וה-18. שני סוגי ה-dpss בשלב שלוהם הם כמעט באותו גודל ומורפולוגיה. תוצאות האימונופנוטיפינג מראות נוכחות של סמני תאי גזע מזנכימליים כגון CD 44, CD 73 ו-CD 19, והיעדר של סמנים המטופואטיים ואנדותליאליים כגון CD 34, CD 45 ו-CD 11 B. באופן מעניין, הביטויים של CD 1 0 5 ו-CD 146 גבוהים יותר ב-outgrown d PSCs בהשוואה ל-D-P-S-C-E-D; הכימות של צביעת enzyme red ביום ה-21 של התמיינות האודונטובלסטים מראה שקיעת סידן רבה יותר ב-D-P-S-C-E-D בהשוואה לתאי גזע ללא con dental top.

תוצאות ה-QPCR מצביעות גם על ביטוי גבוה באופן מובהק של MEP ו-ALP כסמני מינרליזציה ב-D-P-S-C-D בהשוואה לתאי גזע דנטליים ראשוניים. במקביל, שני הגנים מווסתים במהלך הדיפרנציאציה, וכן הביטוי של DSPP כסמן אודונטוגני עלה במהלך הדיפרנציאציה. עם זאת, אין שונות מובהקת בביטוי של DSVP בתאים מודפרנציאצים בין קבוצות ה-ED וה-OG.

הדגמנו כעת כיצד לבודד תאי גזע מחלקי שיניים אנושיים באמצעות דיסוציאציה אנזימטית של הפולפה או על ידי צמיחה של תאי גזע מנתח רקמה (explant). זהו כל התהליך. אני מאחל לכם בהצלחה בניסיון ליישם פרוצדורה זו בניסוי שלכם.

תודה לך.