המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד שלפוחיות APAs מסוג F1 F zero ממוח של חולדה לצורך ביצוע הקלטות patch clamp. פעולה זו משיגה תחילה על ידי הוצאת המוח מהחולדה והומוגניזציה שלו. השלב השני הוא פירוק אזורים סינפטיים באמצעות הפעלת לחץ.

בשלב הבא, מניחים את הסינפטוזומים בשכבות על גבי מדרגי הפייאלים. השלב האחרון הוא דגירה עם digitonin ו-L כדי להפיק את הוזיקולות הסופיות להקלטת patch clamp. תפקוד חשוב של מיטוכונדריה הוא ייצור ATP באמצעות פוספורילציה חמצונית.

האנזים האחראי לייצור ATP הוא ה-ATP synthase הממוקם בממברנה הפנימית של המיטוכונדריה. כדי ללמוד את תפקוד ה-ATP synthase בפירוט, אנו מבודדים שלפוחיות תת-מיטוכונדריאליות מיוחדות שאותן אנו מכנים SMVs. אלו מכילות את אנזים ה-ATP synthase בתצורה הפוכה (inside out).

לאחר מכן אנו מקליטים SMVs אלו באמצעות אלקטרודת patch clamp, וקובעים את רמת הדליפות של הממברנה שלהם. נתון זה מלמד אותנו על היעילות של ייצור TP על ידי המיטוכונדריה. את הפרוצדורה הזו תדגים היום Sylvia ti, פוסט-דוקטורנטית במעבדה שלי באוניברסיטת Yale.

בפרוצדורה זו, לאחר קבלת ראש של חולדה באמצעות עקיפת ראש, חתכו את העור כדי לחשוף את הגולגולת, ולאחר מכן פתחו את הגולגולת בעדינות על ידי חיתוכה בעזרת מספריים או מספרי Rons. לאחר מכן, הוציאו את המוח, קצצו את המוח ללא המוזחור, ובסופו של דבר בבידוד בבופר, ואז העבירו אותו להומוגניזטור זכוכית עם טפלון בנפח 5 mL. הומוגניזרו בעדינות את הרקמה 10 פעמים, במשך כ-5 דקות בסך הכל. לאחר מכן, סובבו את הדגימה בצנטריפוגה שולחנית ב-1,500 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C.

שמרו את העילוי המכיל מיטוכונדריה וסינפטוזומים והשליכו את המשקע. לאחר מכן, סובבו אותו שוב בצנטריפוגת שולחן ב-16,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C. כעת, השליכו את העילוי ותלו את המשקע ב-500 µL של בופר בידוד. פצלו את הסינפטוזומים באמצעות מכשיר לפיצול תאים על ידי הפעלת לחץ של 1,200 PSI למשך 10 דקות, ולאחריו דה-קומפרסיה מהירה. העבירו את הסינפטוזומים המפוצלים למבחנות צנטריפוגה עם שני ריכוזים שונים של FiCoN, אשר ייצרו שני שכבות.

כעת מקם את המבחנות ברוטור SW 50.1 וסבב במערך צנטריפוגה במהירות של 126,500 ×g למשך 20 דקות בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס. בעוצמה של אולטרה-צנטריפוגה, המשקע הוא המיטוכונדריה המטוהרת. השכבה שבין הצפיפויות השונות במבחנה היא הסינפטוזום שאינו מפורק.

לאחר מכן, שטפו את המשקע על ידי צנטריפוגה בבופר בידוד במהירות של 16,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס בצנטריפוגה שולחנית. כעת, השעו את המיטוכונדריה ב-200 µL של בופר בידוד, בשילוב עם נפח שווה של 1% digitonin.

הנח את הדגימה על קרח למשך 15 דקות. לאחר מכן, הוסף תמיסת בידוד (isolation buffer) נוספת וסבב במרכזפוגה ב-16,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C. חזור על הליך זה פעמיים, לאחר מכן השהה מחדש את המשקע (pellet) ב-200 µL של תמיסת בידוד, והוסף 2 µL של 10% Lu bra, PX, ערבב והנח על קרח למשך 15 דקות.

לאחר מכן, העבירו את התערובת לשכבות של בידוד במערך של בופר בתוך מבחנות צנטריפוגה. הניחו את המבחנות ברוטור SSW 50.1 ובצעו צנטריפוגה במהירות של 182,000 ×g בטמפרטורה של 4°C למשך שעה אחת. לאחר שעה.

שטפו את המשקע הסופי באמצעות סבב במערך צנטריפוגה בתמיסת בידוד במהירות של 16,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. מערך אלקטרופיזיולוגיה טיפוסי כולל מגבר, מחשב PC המצויד ב-digi data 1, 440, ממשק ממיר אנלוגי לדיגיטלי בשילוב עם תוכנת P clamp, 10.0, מניפולטורים, מיקרוסקופ, שולחן בידוד רעידות וכלוב פאראדיי. ראשית, משכו פיפט מתוך צינור קפילרי מזכוכית בורוסיליקאט באמצעות מושך מיקרו-פיפטים בלהבה של Flaming Brown.

ההתנגדות האופטימלית של הפ pipette צריכה להיות בין 80 ל-100 mega ohm. הוסף את השקיקים הסוב-מיטוכונדריאליים בתמיסה פסיולוגית תוך-תאית. לאחר מכן, מלא pipette של patch clamp באותה התמיסה.

בצעו הדמיה של הוסיקולות תחת מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה לאחר ביצוע פאץ' ל-SMVs בטמפרטורת החדר. רשמו את הפעילות כאשר פוטנציאל הממברנה נשמר במתח הנע בין 100- millivolts ל-100+ millivolts למשך 10 שניות בכל תקופה.

הנתונים שהוקלטו סוננו בתדר של five kilohertz באמצעות מעגלי המגבר ונותחו באמצעות תוכנת clamp fit 10.0. איור זה מציג את הבלוט (blot) של ליזאט שהוכן מציטוזול וממיטוכונדריה. הפאנל העליון מציג אימונו-בלוט המשתמש בנוגדן נגד החלבון הציטוזולי GA dh.

הפאנל התחתון מציג Blot באמצעות נוגדן נגד החלבון של הממברנה הפנימית של המיטוכונדריה, Cox four. כאן מוצגות שתי הקלטות patch clamp מייצגות לפני ואחרי הוספה של 1 mM ATP. פוטנציאל ההחזקה הוא 70+ mV. הקו המקווקו מייצג 0 pA.

כל עקבה נרשמת למשך 10 שניות, וישנם 10 שניות בין העקבות המוצגות. להלן דוגמאות לעקבות של שינויים בעוצמת הפלואורסצנציה של אינדיקטור CMA לאורך זמן בנוכחות SMVs, וכן בהיעדר ובנוכחות של TP. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להגיע להבנה טובה של אופן בידוד מיטוכונדריה, ושליפת שלפוחיות תת-מיטוכונדריאליות המכילות F1 FO 80 TP Synthes. יתרה מכך, עליכם להבין כיצד ליצור חסימה עמידה באמצעות אלקטרודה על ממברנת השלפוחיות כדי לנתח את פעילות התעלה של קומפלקס A TP Syntase.