באמצעות PCR כמוני בזמן אמת לקביעת engraftment תא התורם במודל תחרותי Murine מח עצם השתלה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע טכניקה מבוססת PCR לכימות השתלת תאי תורם במודל השתלת מח עצם עכברי תחרותי, זה מושג על ידי ביצוע השתלת מח עצם בעכברים מושתלים נקבות באמצעות תאי תורם זכרים. לאחר מכן, דם היקפי נאסף מעכברים נמענים בנקודות זמן שונות וה-DNA הגנומי מבודד. הדגימות מוכנות לעקומה סטנדרטית.

לבסוף, PCR בזמן אמת מתבצע עם דגימות סטנדרטיות ודגימות בדיקה. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות את ההשתלה של תאים שמקורם בתורם זכר בעכברים הנקבות המקבלות באמצעות חישוב מול עקומה סטנדרטית עם אחוז ידוע של DNA זכר לעומת נקבה. היתרון הגברי של טכניקה זו על פני שיטה קיימת כמו שיטה מבוססת זרימה ציטומטרית, הוא שהיא רגישה יותר, חסכונית יותר וניתן לאחסן דגימות לאורך זמן.

והכי חשוב, הטכניקה שלנו אינה תלויה במחרוזת וניתן להשתמש בה לכל רקע גנומי של עכברים כמו סמן משטח תא מוגדר היטב כדי להבדיל בין התא התורם לתאי הנמען לאחר המתת חסד של FVB nj, עכברים תורמים זכרים ונקבות מתחת למכסה זרימה למינרי משתמשים במספריים ומלקחיים קטנים כדי לנתח את עצמות הירך והשוק ולהניח אותם בצלחת תרבית רקמה בגודל 60 מילימטר המכילה שישה מיליליטר קר כקרח RPMI 1640 עם 5% חום מושבת. FBS השתמש במגבון קים כדי להסיר שרירים ורקמות אחרות ולחתוך את שני הקצוות של כל פיר עצם בצלחת. לאחר מכן חבר את קצה העצמות למחט בגודל 23 המחוברת למזרק של שלושה סמ"ק מלא RPMI 1640 עם FBS מושבת חום של 5% ושטוף את המח.

השתמש באותה מחט כדי לפרק את רקמת מח העצם על ידי שאיפות חוזרות ונשנות. העבירו את תרחיף התאים לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר וסובבו אותו למשך חמש דקות ב-400 גרם.לאחר הסרת הסופרנט, השעו מחדש את התאים במיליליטר אחד של טמפרטורת החדר, ליזה של כדוריות דם אדומות, חוצצים ודגרו בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות לפני הוספת חמישה עד 10 מיליליטר של RPMI 1640 עם FBS מומת חום של 5% העבירו את התאים דרך מסננת תאים ואספו את הזרימה לתוך צינור. לאחר סיבוב התאים במשך חמש דקות ב-400 גרם והסרת הסופרנטנט, הכדור אמור להיות חסר בצבע אדום המציין הסרה מלאה של כדוריות דם אדומות שהושעו מחדש ב-10 מיליליטר של RPMI 1640 עם FBS מושבת חום של 5% לאחר מערבולת עדינה, הוסף אליקוט קטן לציטומטר המו וספירת התאים.

חשב את נפח התאים הנדרש לערבוב עם תאים נקביים מתחרים ביחס של חמישה לשניים להשתלת מח עצם. כשלב אחרון להכנת תאים להזרקה, ערבבו את התאים התורמים והמתחרים, שטפו את התאים ב-PBS והשעו מחדש ב-PBS בריכוז סופי של חמש פעמים 10 עד השישית לתאי תורם מיליליטר ופעמיים 10 עד השישית למיליליטר לתאים מתחרים, ארבע עד שש שעות לפני השתלת מח עצם. להקרין עכברים מושתלים נקבות עם קרינת גמא צזיום 1 37 במינון יחיד של 11 אפורים.

הניחו את העכברים הנקבות המוקרנות במסננת עכברים והזריקו את תאי התורם והמתחרים המעורבים דרך וריד הזנב בנפח כולל של 0.1 מיליליטר כך שכל עכבר יקבל חמש פעמים 10 לתאי התורם החמישי ופעמיים 10 לתאי מח העצם המתחרה החמישי כדי לשאוב דגימות דם. לאחר ההרדמה, העכברים אוספים כ-50 מיקרוליטר דם לתוך צינורות מצופים EDTA על ידי דימום רטרואורביטלי. אסוף גם דגימות מעכברים זכרים ונקבות תואמי גיל.

לאחר מכן לבודד DNA גנומי מעכברים ועכברים נבדקים. עבור העקומה הסטנדרטית, הוסף כ-200 מיקרוליטר של מאגר ליזה RBC בטמפרטורת החדר לכל דגימת דם ודגר למשך חמש דקות. הוסף מיליליטר אחד של PBS וסובב כלפי מטה כדי להסיר את רוב ה-RBCs הליזים.

לאחר מכן השתמש בערכת מיצוי DNA בדם כדי לבודד את ה-DNA ולחמם מראש את המאגר האלוציאני ל-37 מעלות צלזיוס. כדי לשפר את התשואה, מדוד את ריכוז ה-DNA של כל דגימה. אלה עם יחס OD שניים 60 לשניים 80 בין 1.8 ל-2.0 משמשים לניתוח נוסף.

כדי להגדיר עקומה סטנדרטית, יש לדלל את ה-DNA הזכרי והנקבי לריכוז של ארבעה ננוגרם למיקרוליטר ולהכין את תערובת ה-DNA בהתאם להנחיות אלה. הגדר את לוחית תגובת ה-PCR על ידי ערבוב מגיב סופר מיקס ירוק סייבר עם הפריימרים המוצגים כאן ו-DNA גנומי. כל תגובה של 20 מיקרוליטר מכילה 400 ננו מולר מכל פריימר וחמישה מיקרוליטרים של DNA גנומי של תאי דם הפועלים בשלוש עותקים.

בצע PCR בהתאם לתנאים המצויים בפרוטוקול הטקסט וקבל את ערכי סף המחזור או ה-CT. חשב CT דלתא כפול הכמות CT בחזקת ZY אחד פחות CT בחזקת BCL שתיים וה-ZY רמות ביטוי אחת או שתיים בחזקת מינוס דלתא CT ליצור עקומות סטנדרטיות על ידי התוויית הממוצע של שניים משולשים בחזקת ערכי CT דלתא לאחוז הידוע של DNA זכר בתערובת עם התאמת רגרסיה ליניארית מוצגת. להלן דוגמאות לעקומות סטנדרטיות המשורטטות עם ערכים ממוצעים של שתיים בחזקת דלתא CT כנגד אחוזי הדנ"א הגברי.

תרשים זה כולל טמפרטורת התכה ספציפית עבור אמפליקונים BCL 2 ו-ZFY 1 הממוקמים ב-78.5 ו-88.5 מעלות צלזיוס בהתאמה. BCL 2 משמש כגן ייחוס לנורמליזציה של הכמות הכוללת של DNA טעון בכל תגובת PCR. שתי עקומות הגברה של BCL עבור כל דגימה סטנדרטית מתמזגות זו עם זו ללא תלות בריכוז ה-DNA הגברי המצביע על כמויות שוות של DNA טעון.

עם זאת, עקומות הגברה של ZFY 1 נדדו שמאלה עם כמויות הולכות וגדלות של DNA זכרי בדגימה של תאי גזע המטופויאטיים מעכברי PIM TKO יש פגמים בשחזור עכברים מוקרנים קטלניים, וכצפוי לעכברים מושתלים שהושתלו בתאי PIM TKO היה אחוז נמוך בהרבה של תאים זכריים בהשוואה לעכברים שהושתלו עם תאים מסוג בר. כדי לאמת את השיטה שלנו, בדקנו השתלת תאים מתורם זכר בעכברים נקבות מושתלות, וקיבלנו תאי מח עצם מסוג בר לעומת עכברי PIM משולש או TKO בנקודות זמן שונות לאחר ההשתלה, הן דם היקפי לאחר שישה שבועות והן דגימות מח עצם לאחר 16 שבועות. נותחו לאחר צפייה בסרטון זה.

אתה צריך להבין היטב כיצד להשתמש בשיטה מבוססת PCR כדי לכמת את השתלת תאי התורם במודל תחרותי של השתלת מח עצם ימי.