Electrotaxis מבוסס microfluidic לניתוח כמותי על פי דרישה של Elegans Caenorhabditis 'נידות
2 במאי 2013
שיטת מייקרו אלקטרו fluidic חצי אוטומטית כדי לגרום לתנועה על פי דרישה ב Elegans Caenorhabditis מתואר. שיטה זו מבוססת על תופעת neurophysiologic של תולעים המגיבים לשדות חשמליים קלים ("electrotaxis") בתוך ערוצי microfluidic. Microfluidic electrotaxis משמש כטכניקה מהירה, רגישה, בעלות נמוכה, וניתן להרחבה למסך לגורמים המשפיעים על בריאות עצבית.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות חריגות באיתות עצבי ועצבי-שרירי באורגניזם המודל של C Allergan בעקבות חשיפה כימית או מניפולציה גנטית. זה מושג על ידי תכנון וחריטה של תבנית מיקרו-ערוצים לתוך פרוסת סיליקון. במהלך השלב השני, תבנית הסיליקון משמשת ליציקת ערוץ מיקרו אחד או יותר מ-PDMS.
לאחר מכן רכיבי אביזרים מחוברים לתבנית ה-PDMS. לאחר מכן, התנהגות התולעים בזמן שהן מגרות לשחות דרך המיקרו-ערוץ מתועדת באמצעות מצלמה המותקנת במיקרוסקופ. בסופו של דבר, מיקרופלואידיקה אלקטרו משמשת לקביעת השינויים בנמטודות, במערכות העצביות והשרירים עקב מניפולציה כימית או גנטית עם תנועה כקריאה.
אז היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני הטכניקות הקיימות, במיוחד מבחני ההתנהגות המבוססים על לוחות, הוא שבעזרת טכניקה זו, ניתן לשלוט היטב בכיוון התנועה של התולעת, מה שמאפשר כימות מדויק של התנהגויות הקטר כגון תדירות כיפוף הגוף, זמן סיבוב ומהירות שחייה. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בהפרעות ניווניות כמו פרקינסון ואלצהיימר מכיוון שניתן להשתמש בה כדי לסנן גורמים כימיים וגנטיים בעלי תכונות נוירו-פרוטקטיביות. הרעיון לטכניקה זו עלה לנו לראשונה כאשר הבנו שחסרה שיטה לניתוח התנהגות התנועה של השיטה בצורה כמותית.
התנועה היא רצונית ואקראית, וקשה לאפיין אותה. אז רצינו לבסס שיטה קלה שכולם יכולים ללמוד כדי לגרום לתבנית המאסטר להתחיל בשטיפה של פרוסת סיליקון בגודל 3 אינץ' באצטון ולאחר מכן מתנול למשך 30 שניות כל אחד. לאחר מכן שטפו את הוופל במים נטולי יונים למשך חמש דקות.
לאחר מכן, השתמש באקדח ניפוח חנקן כדי לייבש את משטח הוופלים ולאחר מכן לחמם את הוופל על פלטה חמה ב-120 מעלות צלזיוס לאחר שתי דקות, פלזמה מחמצנת את פני השטח של פרוסת הסיליקון ב-50 וואט למשך דקה אחת. כעת באמצעות שלושה מיליליטר של SU 8 100 התנגדות לצילום מצפים את משטח הוופל ב-1,750 סל"ד למשך 40 שניות, ולאחר מכן אופים מראש את הוופל המצופה על פלטה חמה ב-65 מעלות צלזיוס. לאחר 10 דקות מעלים את הטמפרטורה ל 95 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות ואופים את הוופל במשך שעה נוספת.
לאחר הוצאת הוופל מהפלטה החמה, סדרו מסכת צילום בעיצוב הרצוי מעל הוופל. חשוף את עמידות הצילום לאור UV למשך 95 שניות. לאחר מכן אופים את הוופל על צלחת חמה תוך שימוש באותו שיפוע טמפרטורה המשמש לאפייה מראש לאחר האפייה.
טבלו את הוופל ב-SU שמונה. פתח פתרון למשך 10 עד 15 דקות. שוטפים את הוופל באיזופרופנול כדי לאשר את השלמת פיתוח העיצוב.
לאחר מכן יש לשטוף במים נטולי יונים למשך 30 שניות. לבסוף, מייבשים את הוופל בעזרת אקדח חנקן ואופים קצרות בחום של 120 מעלות צלזיוס. כעת, הניחו את תבנית המאסטר המפוברקת כמו גם פרוסת סיליקון ריקה בשתי צלחות פטרי נפרדות מרופדות בנייר אלומיניום.
יוצקים 20 מיליליטר של פולימר PDMS לתבנית ולצלחת המאסטר, ו -15 מיליליטר לתוך צלחת הוופל הריקה. לאחר מכן, לחץ בעדינות על הוופלים בעזרת מוליך עץ חד פעמי כדי לחסל כיסי אוויר מתחת לווופלים, ולאחר מכן כסה את שני הכלים והניח אותם בצד למשך יום לריפוי. לאחר שהפרוסות נרפאו, הסר את נייר הכסף וקילף את ה-PDMS.
לאחר מכן השתמש בחד-קרן האריס בגודל 2.5 מילימטר כדי לנקב יציאות גישה לנוזלים בשני קצוות התעלה ב-PDMS מתבנית המאסטר. חותכים את שני דיסקי ה-PDMS לרצועות בגודל דומה. ואז בחדר נקי, טען את התעלה, את רצועת ה- PDMS הריקה ושקופית זכוכית לתוך מחמצן פלזמה.
חשוף את החומרים לפלזמת חמצן בעוצמה של 40 וואט למשך 40 שניות. לאחר מכן הדביקו את חתיכת התעלה ואת מגלשת הזכוכית לצדדים מנוגדים של הרצועה הריקה והניחו את החומרים בצד להשלמת ההדבקה. לאחר שעתיים, השתמש בפולימר PDMS כדי לחבר שתי חתיכות של צינורות פלסטיק באורך של לפחות שישה סנטימטרים למאגרים המנוקבים על פלטה חמה ב-120 מעלות צלזיוס.
אפשר ל-PDMS להתרפא לפני שתמשיך. לאחר מכן הצמד מחבר פלסטיק נוזלי לאחד הצינורות כדי לאפשר חיבור מזרק. כעת, הכנס אורכי שלושה אינץ' של חוט נחושת מבודד בגודל 22 לכל מאגר בין צינור הכניסה לתעלה המאבטחת את החוטים עם יותר פולימר PDMS מראש.
התחל שלב זה על ידי הצבת המיקרו-ערוץ שהורכב זה עתה על שלב מטלטלין XY של מיקרוסקופ עם מצלמה מותקנת המחוברת לצג, חבר את ספק הכוח לאלקטרודות המיקרו-ערוצים. לאחר אישור שההתנגדות של המיקרו-ערוץ היא בסביבות 0.6 מגה אוהם, חבר את צינור הפלט של המיקרו-ערוץ למזרק חד פעמי. לאחר מכן טבלו את הפה של צינור הכניסה לתמיסה של נמטודות התלויות במאגר הפיזיולוגי M nine.
הפעל לחץ שלילי בתוך המזרק כדי לשאוב נוזל לתעלה. כאשר צינורות הכניסה והיציאה מלאים, נתק את המזרק וההידרוסטטי. תפעל את הזרימה על ידי התאמת הגובה היחסי של הצינורות כדי למקם תולעת במרכז התעלה.
לאחר מכן הנח את שני הצינורות שטוחים באותו גובה כדי לשמור על זרימה אפסית בתוך המיקרו-ערוץ. בעת החלפת דגימות תולעת במהלך ניסוי מוניות אלקטרו, לאחר פילוס שני צינורות הכניסה לאותו גובה, אם עדיין יש זרימה, בצע התאמות קטנות לגובה הצינור ביחס זה לזה. אם אי פעם איננו בטוחים אם הזרימה היא באמת אפס, אנו יכולים לגרום להיפוך בתנועת התולעת על ידי שינוי הקוטביות של השדה החשמלי ולאחר מכן הערכת המהירות הליניארית של התולעת כשהיא מסתובבת.
כעת הגדר את ספק הכוח למתח המתאים. הפעל את האות החשמלי ואפשר דקה אחת של חשיפה מוקדמת לתולעת להתאקלם בשדה שבמהלכו התולעת אמורה להתחיל לנוע לעבר הקתודה בחלוף הדקה. התחל להקליט.
בסיום הניסוי, הסר את כל הנוזלים והתולעים מהתעלה. שוטפים את החדר במים נטולי יונים ומשאירים את המכשיר על פלטה חמה בטמפרטורה של 125 מעלות צלזיוס לייבוש. בסרטון מייצג זה, מוצג ציר אלקטרו של נמטודות צעירות מסוג בר ומיקומו ומהירותו מתוכנת מעקב התולעים.
הסרטון מתחיל עם הקתודה מימין. המראה של פיפטת הזכוכית מעיד על ההיפוך המתקרב, ההסרה הבאה של אותות הפיפטה. רגע ההיפוך כאן, הנתונים עבור מיקום מול זמן ומהירות מיידית לעומת תפוקות זמן של תוכנית מעקב התולעת המותאמת אישית עבור התולעת בסרטון מוצגים התוכנית חישבה את עקומת המהירות מעקומת זמן המיקום.
תרשים קופסה זה מציג נתוני מהירות חשמלית מקבוצה של בעלי חיים פראיים ובעלי חיים טרנצ'גניים. בעלי החיים הטרנסגניים T מבטאים את הגן אלפא-סינוקלאין האנושי בשרירי דופן הגוף תחת שליטת מקדם הגנים הכבדים של מיוזין UNC 54, הגורם לצבירת חלבונים ומתבטא בתגובה אלקטרו טקטית איטית יותר מזו של חיות בר. לאחר השליטה, ניתן לבחון יותר מ-20 תולעים בכל שעה אם ניסוי המוניות החשמליות מבוצע כראוי.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שרק מוטציות וכימיקלים המשפיעים על תנועה או תחושת אלקטרו ייצרו פנוטיפים הניתנים לזיהוי על ידי מבחן המסים החשמליים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לעצב סיליקון. הרכבנו תעלה מיקרופלואידית וכיצד לנתח תנועה של שיטת N באמצעות בדיקת axxis.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה מיקרו-אלקטרו-פלואידית חצי-אוטומטית להשראת תנועה לפי דרישה ב-Caenorhabditis elegans. הטכניקה מנצלת את תופעת האלקטרוטקסיס, ובכך מאפשרת סריקה מהירה של גורמים המשפיעים על בריאות נוירונלית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- מיקרופלואידיקה
- ניתוח התנהגותי
רקע
- Caenorhabditis elegans הוא אורגניזם מודל לחקר סיגנלינג עצבי ונוירו-שרירי.
- אלקטורוטקסיס היא תגובה נוירופיזיולוגית לשדות חשמליים.
- תעלות מיקרופלואידיות מאפשרות ניסויים מבוקרים באורגניזמים קטנים.
- הבנת הלוקומוציה יכולה לחשוף תובנות לגבי בריאות נוירונלית.
מטרת המחקר
- לזיהוי הפרעות באותות עצביים ונוירו-שריריים.
- להערכת השפעות של חשיפה כימית או מניפולציה גנטית.
- לניצול התנועתיות כמדד לשינויים עצביים ושריריים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תכנון וחריטה של תבניות מיקרו-ערוצים בתוך פרוסות סיליקון.
- יציקת מיקרו-ערוצים מ-PDMS באמצעות תבניות סיליקון.
- חיבור רכיבי עזר לתבנית ה-PDMS.
- הקלטת התנהגות תולעים באמצעות מצלמה המותקנת על מיקרוסקופ.
תוצאות עיקריות
- השראה מוצלחת של תנועה ב-C. elegans באמצעות אלקטרוטקסיס.
- זיהוי שינויים במערכות העצבים והשרירים.
- הדגמה של אלקטרוטקסיס במיקרופלואידקה כשיטה ניתנת להרחבה לסריקה.
- תובנות לגבי השפעות של מניפולציות גנטיות וכימיות.
מסקנות
- אלקטרוטקסיס במיקרופלואידקה הוא כלי בעל ערך למחקר במדעי המוח.
- שיטה זו מספקת גישה רגישה ובעלות נמוכה לבדיקת בריאות נוירונלית.
- יישומים נוספים עשויים לשפר את ההבנה של הפרעות נוירומוסקולריות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח כמותי של תנועה ב-C. elegans מאפשר סריקה בthroughput גבוה של תרכובות נוירו-פרוטקטיביות ומודיפיקטורים גנטיים במודלים של מחלות נוירודגנרטיביות. על ידי המרה של פגמים באיתות עצבי לתגובות אלקטרוטקטיות מדידות, שיטה זו תומכת בתיקוף מוקדם של מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בתהליכי גילוי. הפורמט המיקרופלואידי מספק תוצאי פנוטיפ שניתן לשכפל ולהרחיב, ובכך משפר את הביטחון החזוי בקמפיינים לזיהוי מובילים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן השערות טיפוליות על ידי קישור תפקוד נוירונים דופמינרגיים לפנוטיפים של תנועה הניתנים לכימות.
- ערך תפעולי: מאפשר הערכה מהירה של מניפולציות גנטיות וכימיות המשפיעות על סיגנל נוירונלי באמצעות גירוי אלקטרוטקסי לפי דרישה.
- ערך חזוי: תומך במיון של פורטפוליו תרופות על ידי זיהוי תרכובות המשקמות פגמי תנועה במודלים של PD לפני מחקרים יקרים ביונקים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מייצר פלטים כמותיים וסטנדרטיים, כגון מהירות שחייה ותדירות כיפוף הגוף, לצורך מוכנות הבדיקה.
- ערך תפעולי: מאפשר פוטנציאל לאוטומציה באמצעות בקרה מיקרופלואידית של מיקום התולעים והיפוך קוטביות השדה למדידת זמני היפוך.
- יכולת הרחבה (Scalability): מאפשר סריקה של למעלה מ-20 תולעים בשעה, ובכך מאפשר סריקות ראשוניות יעילות של גורמים נוירו-פרוטקטיביים.
מחקר תרגומי ו-Preclinical
- המשכיות תרגומית: משתמש בתנועה כמדד תפקודי רלוונטי למחלה, המתואם עם ניוון עצבי דופמינרגי במודלים של PD ב-C. elegans.
- הסרת סיכונים מכניסטיים: מבחין בין השפעות נוירוטוקסיות לבין רעילות כללית על ידי בידוד פגמים באותות עצביים באמצעות שינויים בתגובה אלקטרוטקטית.
- התאמה למסמני ביולוגיים: תומך בפיתוח מסמנים ביולוגיים תרגומיים על ידי כימות שונות אלקטרוטקטית תלוית-גיל בצעירים מול זחלים.
שילוב תהליכי עבודה ופייפליין
בדיקת האלקטוטקסיס המיקרופלואידית משולבת בתהליכי הגילוי כפלטפורמה לסריקה פנוטיפית בין אישור המטרה (hit confirmation) לאופטימיזציה של המולקולה המובילה (lead optimization), ומספקת תובנות מכניסטיות לגבי חיוניות נוירונלית.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי גנים ותרכובות נוירופרוטקטיביות על ידי כימות ההתאוששות המוטורית במודלים של מחלות.
- סריקה: מספק מדדי תנועה כמותיים הניתנים לשחזור, המאפשרים הערכה של Z'-factor ובדיקת חסינות (robustness) של המערך.
- אנליטיקה: מספק נתוני מיקום ומהירות ברזולוציית זמן לצורך ניתוח קינטי של דינמיקת תגובה אלקטרוטקטית.
- מחקר תרגומי: מקשר לרצף הפרה-קליני על ידי מידול וריאציות בתגובה התלויות בגיל, הרלוונטיות לניוון עצבי המופיע בשלב מאוחר.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר לסריקה רב-פרויקטית של מודולטורים נוירונליים על רקעים גנטיים מגוונים ורקעי זנים כגון C. briggsae.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בסריקה נוירונלית על ידי בידוד התנועה כמדד ספציפי לתפקוד נוירו-שרירי.
- ערך תפעולי: מייעל ומכשיר את הטיפול בתולעים ואת הגשת הגירוי, ובכך מקטין את השונות הנובעת מבדיקות ידניות ומאפשר הדירות בין אתרי מחקר שונים.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי האצת החלטות המשך (go/no-go) באמצעות פרופילינג פנוטיפי מוקדם של מועמדים לנוירופרוטקציה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של פגיעות (hits) בהתבסס על התאוששות אלקטרוטקטית תלוית-מינון במודלים טרנסגניים המבטאים חלבוני מחלה אנושיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בייצור התקנים מיקרופלואידיים, כולל פוטוליתוגרפיה וטכניקות הצמדה של PDMS.
- תלוי בגישה למערכות מצלמה המורכבות על מיקרוסקופ ולספקי כוח תכנותיים לבקרה מדויקת של השדה החשמלי.
- מצריך סטנדרטיזציה של פרוטוקולי הכנת התולעים, כולל סנכרון גילים והתניה בבופר M9.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבת הבדיקה למיני נמטודות אחרים או לגיאומטריות ערוצים משתנות.
- מוגבל לגילוי פנוטיפים המשפיעים על התנועה או על החישה החשמלית, כפי שאישרו חומרי המקור שרק מוטציות או כימיקלים כאלה מניבים תגובות ניתנות לגילוי.
