מחקר נידות כמותית של חי מייקרו אורגניזמים בחופשיות באמצעות ליזר עקיף
25 באוקטובר 2012
אורגניזמים מיקרוסקופים כמו נמטודות שוחים החופשיים ג elegans, לחיות ולהתנהג בסביבה מורכבת בתלת ממד. אנו מדווחים על גישה חדשנית המספקת ניתוח של ג elegans באמצעות דפוסי התאבכות. גישה זו כוללת מעקב המחזוריות הזמנית של דפוסי התאבכות נוצרים על ידי הפניית אור ליזר דרך קובט.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא למדוד תדרי רעד (thrashing frequencies) של אורגניזמים מיקרוסקופיים השוחים בחופשיות. זאת על ידי הכנה ראשונית של דגימת תולעים מיקרוסקופיות, ולאחר מכן, הכנת המערך האופטי.
לאחר מכן, נרשמת תבנית העקיפה שנוצרה על ידי האורגניזמים החיים. לבסוף, הנתונים הרשומים מנותחים כדי לקבוע את תדרי השחייה. בסופו של דבר, ניתוח העקיפה משמש להצגת שינויים בדפוסי התנועה של תולעים שאינן מוגבלות.
היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מיקרוסקופיה מסורתית, הוא שניתן לצפות בדפוסי שחייה בעוד המין נע בחופשיות במרחב תלת-ממדי. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי שחייה חופשית של C. elegans, ניתן להחיל אותה גם על אורגניזמים שקופים, קטנים ומיקרוסקופיים אחרים החשופים לתנאים משתנים. כדי להכין C. elegans לניתוח וידאו, התחילו בשימוש בפינצטה של חוט פלטינה שטוח להעברת 10 עד 20 נמטודות בוגרות ל-NGM טרי.
צלחות פטרי מלאות באגר המכילות נקודות מעגליות קטנות של e coli. אפשרו לנמטודות להטיל ביצים במשך שלוש עד חמש שעות, ולאחר מכן הסירו את הפרטים הבוגרים. כך תוכסו תרבית קטנה ומסונכרנת התפתחותית של 50 עד 150 נמטודות; כדי לגדל את הנמטודות לשלב הבגרות המוקדמת, דגרו את צלחות הפטרי בטמפרטורה של 20 °C למשך ארבעה עד חמישה ימים.
ביום ניתוח הווידאו, השתמשו במיליליטר אחד של מים מזוקקים דה-יוניזים כדי לשטוף צלחת של נמטודות בוגרות צעירות, ובכך אספו 50 עד 150 תולעים מהתרבית הסנכרונית. השתמשו במיקרו-צנטריפוגה כדי לסובב את התולעים לתחתית המבחנה או אפשרו להן לשקוע בכוח המשיכה למשך כ-15 דקות. הסירו את מרבית המים מהמבחנה והחליפו אותם במיליליטר אחד של מים מזוקקים דה-יוניזים כדי לשטוף חיידקים הדבקים לנמטודות.
בעזרת מיקרופיפטה, העבירו חמישה עד 10 נמטודות במים לתוך ויתה (vete) קוורץ. הרכיבו את מערך האופטיקה כפי שמוצג כאן, תוך שימוש בלייזר הליום-ניאון ב-543 nanometer, שתי מראות אלומיניום בעלות פני שטח קדמיים להכוונת קרן הלייזר דרך הויתה, מחזיק ויתה, מסך הקרנה ומצלמה במהירות גבוהה המסוגלת לצלם בכ-240 frames per second. לאחר מכן, השתמשו בחתיכת פאראפילם כדי לכסות את חלקו העליון של הויתה והפכו אותה כדי לערבב את הנמטודות בעמוד המים.
הניחו את ה-vete במחזיק vete כך שהתולעים יהיו בתחילה קרוב לראש ה-vete. בעזרת המראות, כוונו את קרן הלייזר כך שתעבור במרכז ה-vete. מכיוון שהנמטודות דחוסות יותר ממים, הן ינפלו לאט לתחתית ה-vete תוך כדי שחייה בעמוד המים; על מסך ההקרנה, צבעו בשחור את הנקודה המתאימה לקרן הלייזר המועברת כדי להפחית את הפיזור כאשר הקרן המועברת פוגעת במסך ההקרנה.
ביטול או הפחתה של פיזור מהקרן המועברת ימנעו מהמערך של ה-CCD במצלמה להגיע לרוויה עקב הקרן המועברת. כדי להשיג מדד לגודלו של תבנית העקיפה, שרטטו קו באורך של כחמישה סנטימטרים על מסך ההקרנה לצד נקודת קרן הלייזר המועברת, באופן שלא יפריע לתמונת האור העקיף. כבו את תאורת החדר והקליטו תמונות עקיפה על המסך בעוד התולעים עוברות דרך קרן הלייזר.
כדי להכין את נתוני הווידאו, התקינו את תוכנת ניתוח הווידאו הבאה וייבאו את הסרטון לתוכה. הגדירו את נקודת הראשית כך שתחפף את נקודת הלייזר המועברת באמצעות התוכנה. עקבו אחר ההעתק הזוויתי של תמונת העקיפה שנוצרה על ידי כל נמטודה.
העתיקו והדביקו את הנתונים לגיליון אלקטרוני והוסיפו 180 מעלות או PI לכל הזוויות השליליות, כדי להפיק גרף רציף. באמצעות מערך ניתוח הווידאו, מקמו פוטודיודה בעלת שטח קטן מחוץ למרכז תבנית העקיפה, ישירות מול מסך ההקרנה, באמצעות יציאת USB.
חברו את הפוטודיודה לאוסצילוסקופ הדיגיטלי המחובר למחשב. צפו בדפוסי ההסתה על מסך המחשב. שמרו את מערכי הנתונים בפורמט ASCI או בפורמט טקסט כדי לנתח את הנתונים.
השתמשו בווידאו או בתמונה כדי לייבא את הנתונים לתוכנה לניתוח נתונים המסוגלת לבצע התאמה של צורמות גל. השתמשו במינימיזציה של ריבועים פחותים כדי להתאים עקומה סינוסואידלית לצורך קביעת תדירות הרעידה. חשבו את הממוצע של תדירויות השחייה מדגימות שונות, וקבעו את השונות.
במחקר זה נותחו הנתונים סטטיסטית באמצעות ניתוח סבסטיות במימד אחד (single factor ANOVA), ולאחריו מבחן השוואות מרובות של Bonferroni. ערך P נמוך מ-0.05 נחשב למשמעותי מבחינה סטטיסטית עבור דפוסי העקיפה של המודל. התחל בשימוש במיקרוסקופ לצילום תמונות כדי להפיק תמונה.
גררו את התמונה לתוך Mathematica. השתמשו בפקודה binary eyes כדי להמירה לשחור ולבן. לחלופין, השתמשו בפקודה edge detect כדי ליצור תמונה בשחור ולבן, כאשר שני המספרים העוקבים שולטים במידת הגסות של הקווים שיתקבלו.
לאחר מכן, באמצעות הפקודה image data, המיר את התמונה למטריצה של אפסים ואחדים. השתמש בפקודת forer כדי לבצע טרנספורמציה למטריצה, לאחר מכן העלה בריבוע את הערך המוחלט של המטריצה והצג את התמונה שהתקבלה, שהיא תבנית העקיפה המתאימה לתמונה המקורית. בנוסף, השתמש בפונקציית log כדי לכייל את הניגודיות של התמונה.
לבסוף, השוו את תבניות העקיפה של המודל לתבניות העקיפה שהתקבלו מתולעים השוחות בחופשיות. בדוגמה זו, נחקרו *C. elegans* בתוך תא קוורץ (Q-vet), ברוחב של סנטימטר אחד, בעובי של חמישה מילימטרים ובגובה של ארבעה סנטימטרים. דגימת תולעת בודדת באמצעות ניתוח וידאו.
תדירות השחייה הממוצעת שהתקבלה מניתוח וידאו בתעלה בעובי חמישה מילימטרים הייתה כ-2.5 hertz. באופן דומה, דגימה של תולעת בודדת באמצעות שיטת רכישת נתונים בזמן אמת ואוסצילוסקופ דיגיטלי הניבה תדירות שחייה של כ-2.7 hertz. ניתן לחזור על הליך זה עבור תולעות רבות.
מחקר מפורט של תולעים השוחות בחופשיות חשף תדירות שחייה ממוצעת של 2.37 hertz בתוך vete של חמישה מילימטרים. כצפוי, תדירות השחייה גבוהה מזו של תולעה זוחלת. באמצעות שיטת עקיפה זו, נמצא כי תדירויות השחייה הממוצעות של sea elegance, המוגבלת למסגרת של תוכנית מיקרוסקופ, תואמות את הערך שפורסם בעבר של שני hertz.
בעקבות הסרטון. הכנה של נתונים ומידול של תבניות עקיפה כפי שהודגמו בסרטון זה, מאפשרים מידול של תבניות עקיפה בזמן שחייה. בעזרת תמונות של תולעים שהתקבלו באמצעות מיקרוסקופ קונבנציונלי, נעשה שימוש בתבניות העקיפה הממודלות כדי לסמל מחזור שחייה של ה-sea elegance.
מודל מוצלח מורכב מהצלחה פיזית הפיכה של דפוסי שחייה, התואמים את תדרי השחייה. התולעת צריכה להיות באותה צורה בסוף מחזור השחייה כפי שהייתה בתחילתו. לאחר שליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בפחות מדקה עבור כל תולעת באמצעות הדיאטה הצילומית המהירה, תוך צפייה במחזורי השחייה על מסך המחשב.
לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של האופן שבו ניתן להעריך נמטודות השוחות באופן חופשי.
סקירה
מחקר זה מציג גישה חדשה לניתוח התנהגות השחייה של הנמטודה C. elegans באמצעות דפוסי עקיפה. על ידי מעקב אחר המחזוריות הזמנית של דפוסים אלו, חוקרים יכולים להשיג תובנות לגבי תנועתם של אורגניזמים מיקרוסקופיים אלו בסביבה תלת-ממדית.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביופיזיקה
- ניתוח התנהגות
רקע
- C. elegans הוא אורגניזם מודלי לחקר תנועה.
- שיטות מיקרוסקופיה מסורתיות מגבילות את התצפית על אורגניזמים במרחב תלת-ממדי.
- דפוסי עקיפה יכולים לספק שיטה חדשה לניתוח תנועה.
- טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על אורגניזמים מיקרוסקופיים שקופים אחרים.
מטרת המחקר
- למדוד את תדירויות ההתפתלויות של C. elegans ששוחים בחופשיות.
- לנתח דפוסי תנועה באמצעות ניתוח עקיפה.
- לשפר את השיטות הקיימות לתצפית על התנהגות השחייה.
שיטות ששימשו
- הכנת תרבות מסונכרנת של C. elegans.
- הקמה של מערכת אופטית באמצעות לייזר הליום ניאון.
- הקלטת דפוסי עקיפה כשהנמטודות שוחות דרך קרן לייזר.
- ניתוח נתונים באמצעות תוכנת ניתוח וידאו ושיטות סטטיסטיות.
תוצאות עיקריות
- תדר השחייה הממוצע של C. elegans נמדד בכ-2.37 הרץ.
- נצפו הבדלים בתדירות השחייה בהשוואה להתנהגות זחילה.
- הטכניקה מאפשרת תצפית בזמן אמת על תנועה בשלושה ממדים.
- ניתוח סטטיסטי אישר את משמעות התוצאות.
מסקנות
- שיטת העקיפה הזו מספקת כלי חשוב לחקר התנהגות השחייה ב-C. elegans.
- הגישה יכולה להיות מותאמת לאורגניזמים מיקרוסקופיים אחרים.
- מחקרים עתידיים יכולים להרחיב את ההשלכות של דפוסי תנועה בתנאים שונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Quantitative analysis of freely swimming micro-organisms using laser diffraction enables high-throughput, real-time measurement of locomotion in three dimensions, overcoming the constraints of traditional microscopy. This approach provides robust, quantitative outputs for behavioral phenotyping and functional validation in early discovery. The method supports predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for neurobiology and movement disorder research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of neuromuscular function in live, unconstrained model organisms.
- Supports functional target validation by measuring real-time behavioral outputs under varying conditions.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing between normal and perturbed locomotion patterns.
- Provides reproducible, quantitative endpoints for portfolio triage and early-stage decision making.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-throughput measurement of locomotor activity for phenotypic screening.
- Generates reproducible, quantitative data suitable for assay development and compound evaluation.
- Enables rapid comparison of locomotion metrics across experimental conditions and genetic backgrounds.
- Supports platform scalability and reuse for diverse transparent micro-organisms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns behavioral phenotyping with disease-relevant endpoints in neurobiology and movement disorders.
- Provides translational continuity from discovery through preclinical validation of neuromuscular targets.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative, statistically validated outputs.
- Facilitates predictive de-risking for movement-related therapeutic hypotheses.
Pipeline & Workflow Integration
This laser diffraction method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling quantitative behavioral analysis from early target validation through lead identification and preclinical research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying neuromuscular function in live organisms.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible locomotion metrics for compound and genetic screening.
- Analytics: Delivers quantitative frequency measurements and statistical outputs for robust condition comparison.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by aligning behavioral outputs with disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, reusable platform for diverse transparent micro-organism studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuromuscular target validation.
- Operational Value: Standardizes and accelerates behavioral phenotyping with high reproducibility and throughput.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, quantitative endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of movement-related therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical instrumentation and quantitative behavioral analysis.
- Needs access to laser diffraction setup, high-speed imaging, and data analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization of data acquisition and statistical analysis protocols.
- Adaptable to various transparent micro-organisms with appropriate calibration.
- Limited to organisms and conditions compatible with optical diffraction and real-time imaging.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:23
C. elegans Preparation for Video Analysis
2:52
Optical Setup for the Video Analysis
4:36
Video Data Preparation
5:23
Real Time Data Acquistion for Instant Observation of Swimming Frequencies and Data Analysis
6:36
Model Diffraction Patterns Using Mathematica as an Example
7:48
Representative Laser Diffraction Results
9:34
Conclusion
