הערכת תפקוד עורקי התנגדות Murine באמצעות לחץ Myography

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לקבוע את תגובתיות כלי הדם בזמן אמת של עורק עמיד לעכברים במבחנה בתנאים כמעט פיזיולוגיים. זה מושג על ידי הרכבת קטע קטן של הכלי על שתי צינוריות מיקרו ושמירתו בלחץ לומינלי פיזיולוגי. לאחר מכן הכלי מכווץ עם פנילפרין אגוניסט קולטן אלפא אחד כדי לחקור את היכולת של כל תרופה להרחיב את הכלי.

אתגר הכלי המכווץ עם אצטילכולין מעריך את יכולתו להתרחב בזמן אמת באמצעות מנגנון תלוי אנדותל. התוצאות מראות את אחוז השינוי בקוטר הלומן בתגובה לאצטילכולין ומוודאות כי מחסור ב-SGC אלפא אחד גורם לפגיעה בהרחבת כלי הדם התלויה באנדותל. היתרון העיקרי של טכניקה זו בהשוואה לשיטות קיימות כמו ממוגרפיה בחוט, הוא שממוגרפיית לחץ מאפשרת אפיון של כלי מיקרו קטנים, הרלוונטיים יותר לשמירה על הומאוסטזיס לחץ דם מאשר כלי מוליכות גדולים יותר.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הלב וכלי הדם, כגון יתר לחץ דם, שבו כלי דם עמידים למאקרו ממלאים תפקיד קריטי. התחל בהמתת חסד של עכבר עם פנטוברביטל. כעת פתח את חלל הבטן והתחל לנתח את הרקמה המזנטרית.

כעת זהה עורק מזנטרי מסדר שלישי ובודד אותו מרקמת החיבור והשומן. ההבחנה בין עורקים לוורידים ברמת המיקרו-כלי היא בעייתית כאשר אין דם בכלי הדם. אז עדיף לעשות זאת בחיה השלמה.

לאחר מכן, חותכים קטע באורך שניים עד שלושה מילימטרים של עורק מזנטרי מסדר שלישי ומניחים אותו בכלי המכיל ערימות. מאגר PSS. קטע העורק לא אמור להכיל הסתעפות.

הכן את תא המיאו על ידי מילוי עדין של הצינוריות דרך שסתומי כניסה ויציאה עם ערימות תמיסת PSS ממזרק של 10 מיליליטר, שים לב שלחץ מוגזם עלול לפגוע במתמר השברירי המחובר לצינוריות. לאחר מילוי הצינוריות בחוזקה, סגור את שני השסתומים. כעת העבירו את קטע העורק המבודד לתוך החדר והרכיבו קצה אחד של הכלי על הצינורית הימנית.

קושרים אותו בזהירות עם גדיל דק של תפר ניילון באמצעות שטיפת מזרק וממלאים את הכלי בתמיסת ערימה דרך שסתום הכניסה. כעת הרכיבו את הקצה השני של הכלי על הצינורית השמאלית ואבטחו את הצינורית לכלי בעזרת תפר הניילון. מלאו את החדר עד 10 מיליליטר תמיסת ערימה.

בדוק אם יש נזילה על ידי דחיפה עדינה של תמיסת הערימה דרך שסתום הכניסה בעזרת מזרק. כעת הנח את החדר מתחת למצלמת הווידאו. הפעל את החמצן וחמם את החדר ל -37 מעלות צלזיוס בזמן ששסתום הכניסה סגור, מחובר לצינור P אחד ממאגר תמיסת הערימה הראשון.

תן לכל בועה ותמיסה לעבור דרך הצינור עד שאין בועות בצינור. ואז פתח את השסתום. חבר לשסתום השמאלי של החדר עם צינור P שתיים.

כשמגיעים מווסת הלחץ, וודאו כי אין בועות או דליפה במערכת כולה. עבור לתפריט הלחץ בלוח ממשק myo או בתוכנה והפעל את המשאבה תוך כיבוי הזרימה. פתח את התוכנית ולחץ על איסוף.

ניטור וניתוח של לומן הכלי, קוטר כלי הדם ועובי הדופן אפשרי כעת. כדי להעלות בהדרגה את הלחץ הבין-לומינלי, בחר בלחץ P אחד והזן רצף של לחץ עולה. ערכים מחמישה עד 60 מילימטרים של כלי כספית, לפעמים מתפתלים או מתפתלים בזמן שהלחץ עולה, לכן התאימו את המתח או המתח בהתאם בעזרת מיקרו מיקום אנכי או אורכי.

לאחר שהלחץ הוא 60 מילימטרים והאמבטיה היא ב-37 מעלות צלזיוס, יש לאזן את הכלי למשך 45 דקות לפחות ועד שעה במהלך תקופת שיווי המשקל. החלף את תמיסת האמבטיה פעם אחת עם ערימות חמות מראש. כעת, לאחר שהחלק העורקי מאוזן, יש למרוח 10 מיליליטר של תמיסת דה-פולריזציה של אשלגן כלורי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

השריר החלק יתפרק לחלוטין וישיג התכווצות מקסימלית. לאחר השגת התכווצות יציבה, יש לשטוף את האמבטיה בתמיסת ערימה שלוש פעמים במרווחים של 10 דקות. כעת בדוק את כדאיות הכלי ושלמות האנדותל.

ראשית, כווץ מראש את הכלי על ידי הוספת פנילפרין כדי לטפל בחמש שומות שליליות לליטר. כאשר הושגה התכווצות יציבה, בצע עקומת תגובה להרחבת כלי הדם בריכוז מצטבר על ידי הוספה רציפה של מינונים הולכים וגדלים של אצטילכולין מ-10 לשלילי, תשע עד 10 ל-5 שומות שליליות לליטר לאחר מנת האצטילכולין האחרונה. שוטפים את התכשיר בערימות שלוש פעמים במרווחים של 10 דקות.

כעת, קבע את קוטר הלומן הפסיבי על ידי מריחת PSS נטול סידן המכיל שני מילימול של EGTA לליטר מהמעקב המוקלט. מדוד את קוטר הלומן עבור כל תגובת מינון, אשר תשמש לחישוב כל הפרמטרים. בטא את תגובת ההרפיה של אצטילכולין כהשוואה בין הטיפול עם האגוניסט לבין המאגר נטול הסידן במונחים של עד כמה כל אחד מהם שינה את קוטר הלומן מההיצרות המושרה על ידי פנילפרין.

מיוגרפיה של לחץ מצב שימשה לחקר הרפיית כלי הדם בתגובה לאצטילכולין בעורקי עמידות מזנטרית שבודדו מעכברי נוקאאוט מסוג בר ועכברי נוקאאוט מסוג SGC אלפא אחד על רקע S 6 ושחור 6 ומכווצים מראש עם פנילפרין. מחסור ב-SGC אלפא 1 היה קשור לירידה ביכולת של אצטילכולין לגרום להרפיית כלי דם ללא קשר לרקע הגנטי של העכברים שנחקרו. עם זאת, הרפיה תלוית אנדותל של עכברי SGC אלפא אפס אחד נפגעה באופן ניכר יותר ברקע S 6 מאשר ברקע השחור 6.

יחד ממצאים אלה מצביעים על כך שהרגישות המופחתת של כלי הדם להרפיה תלויה באנדותל עשויה לתרום ליתר לחץ דם ספציפי לזן בעכברי נוקאאוט SGC אלפא אחד לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעה או שעתיים אם היא מבוצעת כראוי. בנוסף להליך זה, ניתן לבצע במקביל שיטות אחרות כמו מיקרוסקופיה קונפוקלית על כלי הדם החיים. זה יאפשר, למשל, מדידה של ריכוזי ברזל תוך תאיים שיכולים לסייע בזיהוי מנגנוני איתות בסיסיים.