קביעת מיקרוביאלית התאית אנזים הפעילות במים, קרקעות, ומשקעים באמצעות מבחני Microplate תפוקה גבוהה

המטרה הכוללת של ההליך הבא היא לבחון במהירות פעילות אנזימים מיקרוביאלית חוץ-תאית במגוון סביבות טבעיות. זה מושג על ידי הוספת דגימות של מים או תמיסות קרקע למיקרו-צלחת כדי להניב שכפול הולם כשלב שני, מצע קולורמטרי מלאכותי או פלואורומטרי מתווסף לבארות המיקרופלייט, מה שמאפשר לתגובות אנזימטיות להתרחש. לאחר מכן, נמדדת ספיגה או פלואורסצנטיות על מנת לקבוע את כמות התוצר הסופי המשתחרר במהלך התגובה.

התוצאות מראות הבדלים בפעילות האנזימים החוץ-תאיים בין דגימות בהתבסס על הספיגה או הקרינה של התגובה הסופית. היום אנו הולכים להדגים כיצד למדוד פעילות אנזימים חוץ-תאיים בסביבות טבעיות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח באקולוגיה מיקרוביאלית, כגון שיעורי מים של עיבוד חומר אורגני ומינרליזציה של חומרים מזינים בקרקעות, משקעים ומים בדרך כלל, אנשים חדשים בשימוש בשיטה זו יתקשו בגלל קושי בהפרדת חלקיקים מתמיסת התגובה, במיוחד בעת בדיקת מספר גדול של דגימות.

הדגמה חזותית של הליך זה היא קריטית מכיוון שפריסת צלחת יכולה להיות קשה ללמידה וביצוע מדידות במספר שלבי זמן יכול להפוך את ההליך הזה למאתגר יותר. ניתוח מטרי של פעילות אנזימים חוץ-תאיים לקרקעות ומשקעים מתחיל בהכנת מאגר מצע ותמיסות סטנדרטיות כמתואר בפרוטוקול הטקסט לאדמה, הכינו תרחיץ של כל דגימה לבדיקה בצינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מיליליטר. הוסף ריכוז של כגרם אחד למיליליטר באמצעות מאגר אצטט של 50 מילי-מולרי למשקעים.

הוסף מספיק מאגר אצטט כדי להפוך את התרחיץ לצינור בקלות. הנפח המדויק של התרחיץ הדרוש ישתנה בהתאם למספר האנזימים שנבדקו, אך מומלץ מינימום של חמישה מיליליטר. מערבולת כל slurry עד שכל גושי האדמה או המשקעים התפזרו.

ושימו לב לכרך האחרון. מהדקים את קצה קצות הפיפטה במספריים לפני הפיפטה. מכיוון שתמיסות קרקע נוטות לסתום קצות, מערבולת מחדש כל תרחיץ ומיד פיפטה 150 מיקרוליטר לכל אחת משש הבארות.

על בלוק באר עמוק 96. חשוב למערבולת ביסודיות ובתדירות גבוהה. על מנת לשמור על חלקיקי אדמה בתרחיף, השאר לפחות שתי בארות לכל בלוק ריקות כדי לשמש כבקרת מצע.

הכן 1 96. ובכן לחסום עבור כל אנזים לבדיקה. שפכו כחמישה מיליליטר של מאגר אצטט למאגר פיפטה והשתמשו בצנרת שמונה תעלות כדי להוסיף 150 מיקרוליטר של המאגר לשתי הבארות האחרונות של כל דגימה.

עבור בקרות המאגר לדוגמה ולשתי בארות בקרת המצע. יוצקים כ-10 מיליליטר מתמיסת המצע המתאימה pnitro fennel או PNP לתוך מאגר פיפטה והשתמשו בצנרת שמונה תעלות כדי להוסיף 150 מיקרוליטר מתמיסת המצע לארבע הבארות הראשונות של כל דגימה ולשתי בארות בקרת המצע. שימו לב לזמן בו מתחילה התגובה, ברגע שמוסיפים את תמיסת המצע.

דגרו צלחות בטמפרטורת החדר למשך 0.5 עד ארבע שעות. זמן הדגירה המדויק ישתנה בהתאם לרמת הפעילות בדגימות ולאנזים שייבדק. בזמן שהבדיקות דגירה, הכינו מיקרופלטה אחת שקופה של 96 בארות.

עבור כל בלוק באר עמוק על מנת לקרוא פיפטת ספיגה, 190 מיקרוליטר מים מזוקקים ו -10 מיקרוליטר של נתרן הידרוקסיד מולארי אחד לכל באר של המיקרופלייט. נתרן הידרוקסיד מאט את התגובה האנזימטית ומעלה את ה-pH, מה שמשפר את צבע ה-PNP המשתחרר במהלך התגובה לאחר הדגירה. צנטריפוגה את 96 גושי הבארות ב-2000 עד 5,000 פעמים G למשך חמש דקות כדי לגלול חלקיקי אדמה.

הסרת הנוזל מבלי להפריע לכדור יכולה להיות מאתגרת. יש להימנע משימוש ביותר מדי דגימת אדמה בתחילה. הקפד לצנטריפוגה מספיק זמן והשתמש בתנועה זהירה אך בטוחה כדי למשוך את הנוזל.

השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי למשוך 100 מיקרוליטר מכל אחד. ובכן, היזהר להימנע מהגלולה. העבר את הנוזל לבאר המתאימה על מיקרו-פלטת שקופה מוכנה של 96 בארות הפעל את קורא ה-Microplate והגדר את כל ספיגת רשומת התוכנה הדרושה ב-410 ננומטר לאחר קביעת המסה היבשה של הדגימות כמתואר בפרוטוקול הטקסט, חשב את הספיגה הסופית של כל דגימה על ידי הפחתת ספיגת בקרת הדגימה מספיגת בדיקת הדגימה.

אם לבקרות המצע יש ספיגה גבוהה של יותר מ-0.060, הפחיתו אותם. המשך גם לחשב את פעילות האנזים במיקרומול לשעה לגרם מסה יבשה באמצעות משוואה זו. לאחר ארגון מיקרו-פלטה שחורה לכל אנזים לפי הדוגמה המוצגת בפרוטוקול הטקסט, שפכו כחמישה מיליליטר מדגימת המים הראשונה למאגר פיפטה והשתמשו בצינור שמונה תעלות כדי להזרים 200 מיקרוליטר לכל הבארות.

בעמודה הראשונה של המיקרופלייט השליכו קצות פיפטה משומשים וחזרו על הפעולה לפי הצורך עבור כל דגימת מים כדי למלא עמודות אחת עד תשע. הגדר בקרות כדי לקחת בחשבון דגימות, תקנים, מצע ומרווה על אותה מיקרו-צלחת שחורה כמו הדגימות. בקרות הדגימה מכילות מאגר מים וביקרבונט ואינן משמשות בחישובי הפעילות, אך ידגימו עקביות קריאה לאורך כל הניסוי.

בקרות המרווה מורכבות ממי דגימה וכמות סטנדרטית של תג הפלואורסצנטי ומשמשות למדידת עקיפה של הקרינה. במדגם, מצע מים ובקרות סטנדרטיות מורכבים ממצע מקושר או מתג פלורסנט סטנדרטי בהתאמה ומאגר ביקרבונט. יוצקים כחמישה מיליליטר של מאגר ביקרבונט של חמישה מילי-מולרי למאגר פיפטה נקי.

פיפטה 50 מיקרוליטר של חיץ לבארות מיקרופלייט אחת עד תשע בשורות d ו-e ליצירת שתיים, משכפל בארות של בקרות דגימה לכל קצות פיפטה לשינוי דגימה, ואז מעביר 200 מיקרוליטר של מאגר ביקרבונט לבארות 10 עד 12 בשורות A ו-H. למרות שהאור נשמר בהיר בהדגמה זו למטרות צילום, יש להפחית את תאורת הסביבה על ידי עמעום או כיבוי אורות מכיוון שתקן הפלורסנט רגיש לאור. יוצקים כחמישה מיליליטר של 10 מיקרומולר, ארבעה מתיל מון או MUB למאגר פיפטה נקי, פיפטה 50 מיקרוליטר לבארות מיקרופלייט אחת עד 12 בשורה H.ואז פיפטה 50 מיקרוליטר לבארות אחת עד תשע בשורות G ו-F ליצירת שלושה שכפולים של בקרות מרווה לכל דגימה ובקרות סטנדרטיות כוללות. הנח את המיקרופלייט בחושך או כסה במכסה אטום כדי להפחית את השפלת האור של MUB, הפעל את הפלואוריומטר והגדר את כל התוכנות הדרושות כדי שתהיה מוכנה לקריאה לפני הוספת המצע.

עבור כחמישה מיליליטר של המצע המרופד MUB המתאים למאגר פיפטה נקי, השתמש בצינור 12 תעלות כדי להזרים 50 מיקרוליטר לבארות מיקרופלייט אחת עד 12 בשורה A ולבארות אחת עד תשע בשורות B ו-C ליצירת שלוש, שכפול מבחנים עבור כל דגימה ושלוש בקרות מצע ממשיכות מיד לתעד פלואורסצנטיות. קרא את הקרינה הראשונית מיד לאחר הוספת המצע למיקרופלייט לאחר הקריאה. הקרינה דוגרת על המיקרופלייט בטמפרטורת החדר בחושך או מכוסה במכסה אטום.

כדי להפחית את השפלת האור של MUB. זמן הדגירה הנדרש למדידת פעילות האנזים הפוטנציאלית המקסימלית יהיה תלוי בריכוז האנזים בתוך הדגימה. מכיוון שזה לא ידוע, לפני בדיקת הדגימה, יהיה צורך לקרוא מיקרו-לוח במספר שלבים כפולים.

עבור רוב האנזימים, מרווחים של 10 עד 15 דקות במהלך שעה מתאימים, אם כי חלק מהדגימות עם ריכוזים גבוהים יגיעו לשיא לפני 10 דקות. המשך לקרוא פלואורסצנטיות במיקרופלייט במרווחים המיועדים למשך שעה לפחות. הקפד לשמור על המיקרופלייט מכוסה או בחושך בין הקריאות.

עבור כל דגימה בכל מרווח זמן, חשב את הקרינה הראשונית הממוצעת של הדגימה, הקרינה הסופית הממוצעת של הדגימה, הקרינה הסטנדרטית הממוצעת והפלואורסצנציה הממוצעת של בקרת המרווה עבור כל מרווח זמן. חשב את פעילות האנזים במ 'לשעה למיליליטר. שימוש במשוואה שנמצאת בפרוטוקול הטקסט.

בחנו את ערכי הפעילות המחושבים עבור כל שלב זמן, קבעו את הפעילות הפוטנציאלית הסופית משלב הזמן עם הפעילות הגבוהה ביותר. אם ערכי הפעילות ממשיכים לעלות, ייתכן שיידרשו צעדי זמן מאוחרים יותר. אם ערכי הפעילות יורדים במהלך הריצה, רוץ שוב בצעדי זמן קצרים יותר.

לקרקעות ולמשקעים מימיים יש בדרך כלל רמות ניכרות של פעילות אנזימים חוץ-תאיים כתוצאה מקהילות מיקרוביאליות מחוברות הגדלות על פני החלקיקים. איור זה מראה כיצד פעילות זו משתנה בהתאם לגודל החלקיקים המתקבלים ממשקעי פני השטח של נחל מסדר שלישי בצפון מיסיסיפי. מחקר קודם של USAA הראה כי ניתן להפריד את קהילות החיידקים על חלקיקי משקעים מזרם זה לשלוש קבוצות נפרדות על סמך ניתוח מולקולרי של מבנה הקהילה שלהן.

אלה על חלקיקים של 0.063 מילימטר, אלה על חלקיקים של 0.1, 2, 5, 0, 0.25 ו-0.5 מילימטר ואלה על חלקיקים של מילימטר אחד. ניתוח דפוסים בפעילות אנזימים חוץ-תאיים תומך במסקנה זו, כאשר פוספטאז דומה בחלקיקים של 0.1, 2, 5, 0, 0.25 ו-0.5 מילימטר, אך גבוה בהרבה בשברים של 1 ו-0.063 מילימטר כאשר נמדד באמצעות טכניקת הסובסטרט המקושר PNP. אנזימים אחרים כגון בטא גלוקו ו-n AGAs, מראים שיאים דומים על החלקיקים העדינים ביותר, אך אינם מוגברים על חלקיקים של מילימטר אחד.

הדגשת העובדה שאנזימים שונים עשויים להראות התפלגויות סביבתיות שונות וניתן להבהיר אותם באמצעות בדיקה זו. פסי השגיאה הנמוכים יחסית מראים כי מבחנים מטריים של פעילות האנזים על משקעים ניתנים לשחזור ולכן ניתנים לניתוח סטטיסטי. כאשר משווים דגימות שונות וסביבתיות, מים טבעיים נוטים להיות בעלי פעילות אנזימים חוץ-תאית נמוכה יותר למיליליטר מאשר קרקעות או משקעים לגרם.

ככאלה, יש לבחון את הפלורה באופן מטרי באמצעות מצעים מקושרים MUB. האיור הזה מראה כיצד הפעילות של האנזימים, פוספטאז, בטא, גלוקו ו-NGA משתנה בהתאם לעומק. באגם רדוד בצפון מיסיסיפי, ארה"ב, האגם ידוע כדל בחומרים מזינים, מה שמרמז גם על הפעילות הגבוהה יחסית של פוספטאז ואנזים שמיקרואורגניזמים מייצרים על מנת לרכוש פוספט מתרכובות אורגניות.

עבור כל שלושת האנזימים, דגימות בדיקה שנאספו על פני המים ובעומק של 50 סנטימטרים הראו פעילות דומה. בעוד שהפעילות הייתה מוגברת בדגימה של 100 סנטימטרים, הדגימה נלקחה למעשה מממשק משקעי המים ונוכחותם של חלקיקי משקעים בדגימה ככל הנראה מסבירה את הפעילות הגבוהה יותר שנצפתה בדגימה, במיוחד עבור בטא גלוקו ו-n AGAs. כמו במצעי PNP, פסי השגיאה הנמוכים מראים שאפילו עם שלוש קריאות שכפול בלבד, יכולת השחזור של מבחני פלואורו מטריים באמצעות מצעי MUB גבוהה.

שימו לב שיחידות לפעילות אנזים של דגימת מים הן אינל של הסובסטרט הנצרך, ואילו אלו לפעילות אנזימים על חלקיקי משקעים נמצאות במיקרומול של מצע הנצרך למרות שהגודל ליחידה דומה. זה מדגיש את העובדה שקרקעות ומשקעים נוטים להיות בעלי פעילות חוץ-תאית גבוהה בהרבה מאשר מים טבעיים. זה גם מדגים את הרגישות המוגברת של טכניקת הסובסטרט המקושר ל-MUB ואת הצורך להשתמש בטכניקה זו לבדיקת פעילות אנזימים חוץ-תאיים בדגימות מים לאחר שליטה.

ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לבחון תשע דגימות מים עבור עד אנזימים תוך קצת יותר משעה תוך ניסיון הליך זה עבור קרקעות ומשקעים. חשוב להשתמש בחומר מסיבי ידוע כדי שניתן יהיה לבטא את הפעילות על בסיס משקל יבש. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד פעילות אנזימים חוץ-תאיים ומגוון סביבות טבעיות באמצעות מטרי צבע או טכניקות מטריות נמוכות יותר.