פשוט ויעילה שיטה לגילוי הפעלת פקטור גרעינית בנויטרופילים אדם על ידי זרימת cytometry

ניסוי זה משתמש בזרימה ציטומטרית כדי לזהות ולכמת חלבונים גרעיניים בגרעינים מבודדים ומסומנים חיסונית מניטרופילים כדי לטהר את הנויטרופילים מדם היקפי אנושי. הסר את תאי הדם האדומים עם דקסטרין ואחריו צנטריפוגה שיפוע צפיפות של הפלזמה. לאחר מכן באמצעות נוגדנים נגד קולטנים, עורר את הנויטרופילים המטוהרים באמצעות אינטגרינים או קולטני FC.

המשך לבודד את הגרעינים ולתקן את הדגימות לתיוג חיסוני עם נוגדנים ספציפיים כנגד הגורם הגרעיני המעניין של NU. לדוגמה, NF kappa B סוף סוף מנתח את הגרעינים על ידי זרימה ציטומטרית על מנת לזהות שינויים קטנים בהפעלת הגורם הגרעיני. מתקבלות תוצאות המראות שגירוי של נויטרופילים באמצעות האינטגרינים שלהם מוביל לעלייה בריכוז הגרעיני של גורם השעתוק N של קאפה B מסלולי איתות המובילים להפעלת גורם גרעיני נחקרים בדרך כלל על ידי מבחני גנים מדווחים או על ידי מבחני שינוי ניידות אלקטרופורטיים בתאים ראשוניים.

לעתים קרובות שיטות אלה אינן מתאימות. זרימה ציטומטרית מציעה זיהוי וכימות מהירים של חלבונים גרעיניים בגרעינים מבודדים. התחל עם 10 מיליליטר של דם טרי שנאסף ממתנדבים בוגרים בריאים.

פיפטה שני מיליליטר של תמיסת דקסטרין T 500 6% לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי של 15 מיליליטר. לאחר מכן הוסף 10 מיליליטר דם מעורבב על ידי היפוך הצינור פעמיים או שלוש ואפשר 45 דקות לשקיעת אריתרוציטים על ידי כוח הכבידה בצינור צנטריפוגה חרוטי טרי של 15 מיליליטר. הניחו חמישה מיליליטר של חבילת FI fial.

קצרו את הפלזמה העשירה בלויקוציטים שנוצרה מעל אריתרוציטים משקעים. שכבו אותו בזהירות על גבי חבילת הפיאל ליצירת שני שלבים, צנטריפוגה ב-516 גרם למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנט ושבור את כדורית התא על ידי הקשה של הצינור על המתלה.

ואז השעו מחדש את התאים ב -10 מיליליטר PBS קר. העבירו את תרחיף התא לצינור צנטריפוגה חרוטי של 50 מיליליטר וצנטריפוגה ב-290 Gs למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. שוברים את גלולת התא כמו קודם ומוסיפים 10 מיליליטר של תמיסה היפוטונית.

מערבבים על ידי סיבוב השפופרת בעדינות במשך דקה אחת בדיוק. לאחר מכן, מוסיפים 10 מיליליטר תערובת תמיסה היפרטונית קרה ושומרים על קרח. כעת ספרו את התאים לאחר כדור הנויטרופילים על ידי צנטריפוגה.

אנו משעים את ה-PMN ב-10 עד 7 תאים למיליליטר. ב-PBS קר שומרים על התאים על קרח. Aliquot 100 מיקרוליטר של תרחיף PMN לצינורות אינור של 1.5 מיליליטר.

לאחר מכן מוסיפים את הנוגדן החד-שבטי המתאים ב-10 מיקרוגרם למיליליטר ודוגרים על קרח למשך 15 דקות. כדי לשטוף את התאים, הוסיפו מיליליטר אחד של צנטריפוגת PBS קרה ושאבו את הסופרנטנט. לאחר מכן שוברים בעדינות את כדור התא ושוטפים פעמיים נוספות עם PBS.

כדי להסיר נוגדן לא קשור, השהה מחדש את ה-PMN השטוף באותו נפח ראשוני של PBS חם המכיל 60 מיקרוגרם למיליליטר של דגירה של אנטי מוזה IgG ב-37 מעלות צלזיוס למשך דקה עד 20 דקות, תלוי בגורם הגרעיני המעניין. כעת הוסף מיליליטר אחד של PBS קר לאחר גלולת התאים על ידי צנטריפוגה, הסר את החטף והקפיא את כדורי התאים מיד באמבט אתנול קרח יבש. עבור כל דגימה, הסר את הצינור מסט הקרח היבש מגבון אמבט אתנול נקי והחייאה.

השעו את כדורי ה- PMN הקפואים ב -100 מיקרוליטר של תמיסה היפוטונית. הנח את כל הדגימות על קרח כדי לנטר דגימות לשלמות הגרעין. צביעת Eloqua של תרחיף הגרעינים בכחול טריאן.

אם תרחיף גרעינים מכיל תאים שלמים רבים או פסולת, עדיף להשליך את התכשיר ולהתחיל את ההליך עם דגימה אחרת. לאחר הטלת הגרעינים על ידי צנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט בזהירות רבה ואז כדי לקבע את הגרעינים ב-100 מיקרוליטר של תמיסת אלדהיד קרה, 4% Paraform ולדגור את הגרעינים על קרח. לאחר הטלת הגרעינים הסר בזהירות את החטף ב-100 מיקרוליטר של מאגר חדירה קר ודגר את הדגימות על קרח למשך 10 דקות.

לאחר מכן קצרו את גרעיני הפרם על ידי צנטריפוגה. בשלב זה, כדורי הגרעינים אינם מתחברים היטב בתחתית הצינור. מומלץ להתרכז שוב בעתיד.

אם הגלולה משתחררת כדי לחסום אתרי קשירה לא ספציפיים, אנו משעים את הגרעינים ב-500 מיקרוליטר של סרום בקר קר, 4% עוברי ב-PBS ודוגרים על קרח למשך 20 דקות. גלולה את הגרעינים על ידי צנטריפוגה, ואז השעו מחדש את הגרעינים ו-100 מיקרוליטר PBS קר המכילים 4% FBS ו-2.5 מיקרוגרם למיליליטר של הנוגדן החד-שבטי כנגד הגורם הגרעיני המעניין. דגירה של הדגימות על קרח למשך 20 דקות לאחר שטיפת הדגימות פעמיים עם 500 מיקרוליטר PBS קר עם 4% FBS, אנו משעים את הגרעינים ב-100 מיקרוליטר PBS קר המכיל 4% FBS ו-10 מיקרוגרם מיליליטר של הנוגדן המשני המתאים FZ דגירה על קרח למשך 20 דקות לאחר שתי כביסות, השעו מחדש את הגרעינים ב-400 מיקרוליטר של 4% פרלדהיד קר ב-PBS.

נתח את הגרעינים המסומנים במערכת החיסון בציטומטר זרימה כגון סריקת עובדות או מכשיר דומה. התאם את הגדרות הרכישה שני FSC בסולם לוג ב-10 לשלילי SSC בסולם לוג ב-196 וגרעיני שער בעלילת אימוץ. רכוש 10,000 גרעינים לדגימה.

לאחר מכן נתח את הקרינה של גרעיני כתם פיטסי דרך הערוץ האחד FL המוגדר בקנה מידה של 400. שיטת טיהור PMN זו מספקת בדרך כלל נויטרופילים לא מגורים עם טוהר גדול מ-95% מגרעיני PMN מבודדים עם תשואות גבוהות, מבודדים לגרעינים, ניתן לזהות בקלות כאוכלוסייה שונה מ-PMN שלם בציטומטר הזרימה עם תרשים נקודות בעת גירוי. על ידי קישור צולב של בטא אחד, אינטגרינים NF kappa B מתורגם לגרעין, ועלייה זו ב-NF kappa B גרעיני מזוהה כעלייה בקרינה.

באופן דומה, גירוי של PMN על ידי קישור צולב של בטא שני אינטגרינים גורם גם להפעלת NF kappa B כפי שמצוין על ידי עלייה בקרינה. הרגישות של שיטה זו מאפשרת לזהות שינויים קטנים ברמות הגורם הגרעיני כפי שמעידה העובדה שאינטגריני בטא אחד, הקושרים חלבוני מטריצה חוץ-תאיים כגון פיברונקטין גורמים להפעלת NF kappa B חזקה יותר מאשר בטא שני אינטגרינים, הנקשרים למולקולות הידבקות בתאים אחרים. שיטה זו מציגה גמישות רבה מכיוון שניתן להשתמש בפלואורוכרומים רבים ושונים ומכיוון שהיא מאפשרת הכנת גרעינים מסוגי תאים שונים, השתמשה בגישה הפשוטה והחסכונית הזו למחקרי העברת אותות הכוללים שינויים ברמות החלבון בגרעין של מגוון סוגי תאים.