טכניקת cytometry הזרימה מבוססת תמונה כדי להעריך את השינויים בפונקצית granulocyte במבחנה
26 בדצמבר 2014
שיטה זו מדגימה טכניקה להערכת תפקוד גרנולוציטים על ידי מדידה בו-זמנית של פגוציטוזיס של חיידקים והתפרצות חמצונית. ציטומטריית זרימה מבוססת תמונה אפשרה זיהוי של שלוש תת-קבוצות נפרדות של גרנולוציטים מופעלים שכולן נבדלות ביכולתן התפקודית היחסית.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את תפקוד הגרנולוציטים כגישה דו-פרמטרית. זה מושג על ידי דגירה ראשונה של גרנולוציטים מדגימות דם של מטופלים עם חלקיקים ביולוגיים ומגיב כדי לדמיין את פרץ החמצון. בשלב השני, הפגוציטוזיס שלאחר הדגירה נחסם, ואז מסומנים קולטני פני התא המעניינים כדי לאפשר זיהוי חיובי של הגרנולוציטים.
בסופו של דבר, ניתן לזהות ולבודד את תת-קבוצות הגרנולוציטים המופעלים על ידי ציטומטריית זרימה מבוססת תמונה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי האימונולוגיה התזונתית או הקלינית, כגון כיצד הרגלי תזונה ושיטות תזונה תורמים לשינויים ולתפקוד גרנולוציטים. מי שידגים את ההליך הזה יהיה אריק פראדו, דוקטורנט מהמעבדה שלי.
עם השגת הפשרת דגימת הדם ההיקפית, החלקיקים הביולוגיים של ה-SIUs ו-DHE בטמפרטורת החדר והאתיל באמבט של 37 מעלות צלזיוס B, כאשר הריאגנטים הפשירו, מוסיפים 20 מיקרוליטר של חלקיקי הביו של ssus לארבעה צינורות בודדים של 1.2 מיליליטר בתוך מכסה מנוע סטרילי. לאחר מכן הוסף 40 מיקרוליטר של ה-DHE המופשר לכל צינור המכיל את חלקיקי הביו, והקש בעדינות על הצינורות על הספסל כדי לאסוף את המגיב בתחתית הצינורות. לאחר הוספת 100 מיקרוליטר של דם מלא מעורב לכל צינור, הסר את כל הדם המזהם לאורך הקצה הפנימי של הצינורות בעזרת מוליך עם קצה כותנה וערבב את הדם והריאגנטים עם פיפטה אלקטרונית המוגדרת לשלושה מחזורים.
לאחר המחזור השלישי, הניחו את כל הצינורות בדלי קרח מוגן מפני אור. לאחר מכן דגרו את הצינורות למשך 10, 20 או 40 דקות באמבט במהירות של 37 מעלות צלזיוס, החל מהצינור של 40 דקות כדי להבטיח שכל הדגירות יסתיימו באותו הזמן. בתום הדגירות יש להוציא 15 מיקרוליטר של אתיל מלאם לכל אחד מהצינורות.
לאחר 30 דקות יש לדגור על התאים עם 10 מיקרוליטר כל אחד מהנוגדנים המתאימים. לאחר שעה נוספת דגרו את התאים ב-750 מיקרוליטר של תאי דם לבנים לתקן תמיסת כיני תאי דם אדומים. לאחר שעה נוספת, צנטריפוגת הדגירה של התאים ושואבת בוואקום את הסופרנטנט, ומשאירה נפח נוזל שיורי של 100 מיקרוליטר מעל כדורית התא.
כעת הוסף 10 מיקרוליטר של שבעה A a d מדולל טרי, 50 מיקרוליטר PBS ו-25 מיקרוליטר חרוזי כיול לכל דגימה. לאחר מכן מכסים את הצינורות, עוטפים אותם בנייר כסף ומאחסנים אותם בארבע מעלות צלזיוס. כאשר ציטומטר הזרימה מבוסס התמונה מוכן, הפעל כל צינור דגימה שאוסף מינימום של 3000 אירועי אתר ULU באמצעות פרמטרים מוגדרים מראש כדי לנתח את הדגימות.
השתמש באשף פיצוי התוכנה האוטומטי של תוכנת IDEA כדי להחיל מטריצת פיצוי על קובצי התמונה הגולמית וליצור קובצי תמונה עם פיצוי. לאחר מכן טען את קבצי ה-CIF הבודדים בתוכנת IDEA וצור את העלילות הבאות כדי לזהות את תת-קבוצות הגרנולוציטים עבור כל דגימת מטופל. השתמש תחילה בבקרה הלא מגורה כתקן ייחוס, השתמש בהיסטוגרמה של ריבוע ממוצע שורש שיפוע השדה הבהיר כדי לקבוע את השערים הראשוניים ולזהות את התאים שנחשבו למוקד.
לאחר מכן כדי להפריד את תאי הסינגל מהפסולת והכפולים, צור עלילת נקודות של יחס הגובה-רוחב של Brightfield לעומת אזור השדה הבהיר. לאחר שזוהתה אוכלוסייה נקייה של תאים, קבע תרשים נקודות של CD 45 לעומת CD 66 B.To זהה באופן חיובי את הגרנולוציטים החיוביים CD 45 CD 66 B. לבסוף, צור תרשים נקודות של עוצמת הפרטים הבהירים עבור האאוראוס לעומת עוצמת הפירוט הבהיר עבור פרץ החמצון.
כדי לזהות את תת-הקבוצות של הגרנולוציטים המופעלים האוספים את תמונות השדה הבהיר בערוצים 1 ו-9, את החלקיקים הביולוגיים בערוץ שלוש, את ה-DHE בערוץ ארבע, את ה-7 a a d בערוץ חמש, את ה-CD 66 B בערוץ 11 ואת ה-CD 45 בערוץ 12, ניתן ליצור גם שכבת על של שני צבעים המתארת אירועי חלקיקים משולבים של DHE וביו. באמצעות ציטומטריית זרימה מבוססת תמונה, ניתן להפריד אוכלוסייה הומוגנית של גרנולוציטים מופעלים לשלוש תת-קבוצות הפעלה שונות. בשיטה זו, הדרך היעילה ביותר לפתור את שלושת תת-הקבוצות היא על ידי התוויית עוצמת הפירוט הבהיר עבור הפגוציטוזיס לעומת ההתפרצות החמצונית.
שימוש נוסף באשף הקולוקליזציה בתוכנת IDEAS מאפשר לכמת את הנוכחות של הפגוציטוזיס בו זמנית והתפרצות החמצון של הגרנולוציטים, סימן היכר להפעלה גבוהה. בנוסף, בניסוי זה, תקופת הדגירה של 40 דקות הדגימה את האחוז הגדול ביותר של גרנולוציטים פעילים מאוד. לפיכך, הכללת לפחות שלוש תקופות דגירה בפרוטוקול מקלה על הקביעה כיצד טיפול קליני נתון עשוי לשנות את מצב ההפעלה הזמנית של הגרנולוציטים.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בדיקות מולטיפלקס מבוססות חרוזים כדי לענות על שאלות נוספות. לדוגמה, כיצד משתנה ייצור הכימוקין של GRANULOCYTE בסופינט בעקבות חשיפה לחלקיקים ביולוגיים?
סקירה כללית
שיטה זו מדגימה טכניקה להערכת תפקוד גרנולוציטים על ידי מדידה סימולטנית של פגוציטוזה של חיידקים ושל פרץ חמצוני. ציטומטריה של זרימה מבוססת תמונה אפשרה זיהוי של שלוש תת-קבוצות נפרדות של גרנולוציטים מופעלים, אשר כולן נבדלו ביכולת התפקודית היחסית שלהן.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של התא
- מחקר קליני
רקע
- גרנולוציטים ממלאים תפקיד מכריע בתגובה החיסונית.
- הבנת תפקודם יכולה לספק תובנות לגבי מצבים בריאותיים שונים.
- מחקר זה מתמקד בהערכת ההפעלה והתפקוד של הגרנולוציטים.
- פלוו-ציטומטריה מבוססת תמונה (Image-based flow cytometry) מיושמת לצורך ניתוח מפורט.
מטרת המחקר
- להערכת תפקוד הגרנולוציטים באמצעות גישה בעלת שני פרמטרים.
- לזיהוי תתי-אוכלוסיות של גרנולוציטים מופעלים.
- לבחינת ההשפעה של הרגלי תזונה על תפקוד הגרנולוציטים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- אינקובציה של גרנולוציטים עם חלקיקים ביולוגיים וריאגנטים.
- חסימת פגוציטוזה וסימון קולטנים על פני השטח של התא.
- ציטומטריה זורמת מבוססת תמונה לניתוח של תתי-אוכלוסיות של גרנולוציטים.
- כימות של פגוציטוזה ופרץ חמצוני.
תוצאות עיקריות
- זוהו שלוש תתי-קבוצות נפרדות של גרנולוציטים מופעלים.
- תקופת האינקובציה השפיעה על מצב ההפעלה של הגרנולוציטים.
- ציטומטריית זרימה מבוססת תמונה סיפקה תובנות מפורטות לגבי תפקוד הגרנולוציטים.
- הממצאים עשויים להנחות טיפולים קליניים ופרקטיקות תזונתיות.
מסקנות
- שיטה זו מעריכה ביעילות את תפקוד הגרנולוציטים.
- היא מאפשרת זיהוי של תתי-אוכלוסיות של גרנולוציטים הנבדלות זו מזו מבחינה תפקודית.
- מחקרים עתידיים יכולים לבחון את ההשלכות של תפקוד הגרנולוציטים במצב בריאות ובמחלה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מדידה סימולטנית של פגוציטוזה של גרנולוציטים ושל התפרצות חמצונית (oxidative burst) באמצעות ציטומטריה של זרימה מבוססת תמונה (image-based flow cytometry) מאפשרת פרופיל תפקודי רב-ממדי הקריטי לגילוי תרופות המתמקדות באימונולוגיה. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בשלבים מוקדמים של תיקוף המטרה (target validation) על ידי הפרדה בין פנוטיפי הפעלה מובחנים ודינמיקה זמנית. השיטה תומכת בקבלת החלטות לגבי תיקי פיתוח מותאמות סיכון, בכך שהיא מספקת מדדי קריאה כמותיים וניתנים לשחזור של תפקוד חיסוני הרלוונטיים הן למחקרי גילוי והן למחקר תרגומי.
יישומים אסטרטגיים במו"פ בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של תפקוד תאי מערכת החיסון המולדת באמצעות ניתוח דו-פרמטרי של פגוציטוזה וburst חמצוני.
- תומך בהפחתת סיכונים מנגנונית על ידי הבחנה בין תתי-אוכלוסיות של גרנולוציטים בעלות הפעלה נמוכה, בינונית וגבוהה.
- מסייע בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי כימות שינויים במצבי הפעלה של גרנולוציטים המושרים על ידי טיפול.
- משפר את הביטחון החוזי עבור היפותזות טיפוליות למודולציה של מערכת החיסון.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מכין בדיקות תאי מערכת חיסון רב-פרמטריות ומאומתות עבור תהליכי סינון המשכיים.
- מספק פלטים כמותיים וסטנדרטיים להערכה הדירה של תרכובות.
- מאפשר התרחבות של הבדיקה ושימוש חוזר בפלטפורמה באמצעות ציטומטריה מבוססת תמונה אוטומטית וניתוח מונחה תוכנה.
- תומך במוכנות לסינון חסון על ידי פתרון הטרוגניות תפקודית בתוך אוכלוסיות של גרנולוציטים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימ תבדירי תפקוד חיסוני in vitro עם נקודות קצה של סמנים ביולוגיים הרלוונטיים למחלה.
- מספק רצף משלב הגילוי המוקדם ועד לתיקוף פרה-קליני, באמצעות מעקב אחר תגובות חיסוניות תפקודיות לאורך זמן.
- מאפשר קבלת החלטות על קידום מבוססות התאמה לסיכון, על בסיס פרופילים כמותיים של הפעלה חיסונית.
- תומך בפיתוח ביומרקרים תרגומיים על ידי קישור פנוטיפים תפקודיים להשפעות טיפוליות קליניות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
טכניקה זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי כך שהיא מאפשרת בדיקה של תפקודי מערכת החיסון המבוססת על היפותזה, פיתוח בדיקות (assays) והלימה של ביומרקרים תרגומיים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי כימות מנגנוני הפעלה של גרנולוציטים.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור להערכת תרכובות או טיפולים במערכי בדיקה של תאי מערכת החיסון.
- אנליטיקה: מספקת מדידות רב-פרמטריות ופלט סטטיסטי להשוואת מצבי הפעלה והשפעות טיפול.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין נתוני תפקוד חיסוני in vitro לבין אסטרטגיות של סמנים ביולוגיים פרה-קליניים וקליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה סטנדרטית וניתנת לשימוש חוזר לניתוח תפקודי של תאי מערכת החיסון במגוון תוכניות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות חיסוניות.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והסקלביליות של בדיקות תפקוד חיסוני.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go ויעילות הון על ידי אספקת נתונים תפקודיים חזקים בשלב מוקדם של תהליך הפיתוח.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף וקידום של מועמדים למודולציה חיסונית בהתאם לסיכון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בציטומטריה של זרימה, אימונולוגיה וניתוח כמותי של תמונות.
- נדרשת גישה למכשירים לציטומטריה של זרימה מבוססת תמונה בעלי יכולות דימות כמותי וריבוי לייזרים.
- דורש סטנדרטיזציה חוצת-צוותים של פרוטוקולי gating, פיצוי (compensation) וניתוח.
- עשוי לדרוש התאמה לסוגי תאי מערכת חיסון שונים או למודלים של מחלות.
- תלוי בכלי תוכנה חסונים לניתוח נתונים מרובי פרמטרים ולכימות קולוקליזציה (colocalization).
