Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה.

הליך זה מתחיל בהכנת morpho ו-mRNA עם cap ששוכפל in vitro. ממלאים מיקרופיפטה באמצעות שאיבת התמיסה המכילה את ה-morpho, ולאחר מכן מכיילים את נפח ההזרקה באמצעות במה של תא בודד עם מיקרומטר. לאחר מכן אוספים עוברים של Zebrafish ומסדרים אותם בתא מיקרו-הזרקה להזרקות לתוך החלמון.

מזריקים את תמיסת העבודה לחלמון, ממש מתחת לתא, ומשתמשים בתנועות הציטופלזמה כדי להעביר את התמיסה להזרקות מיקרוסקוپیות לתא. לאחר ההזרקות, מזריקים את התמיסה לציטופלזמה של התא. מדגירים את העוברים בטמפרטורה של 28.5 °C בתווך E3 ובודקים את הפנוטיפים הרלוונטיים בשלבים הבאים.

שלום, אני שיילו יואן מהמעבדה, בנו של ד"ר סשה וממחלקת הגנטיקה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת יאל. היום נדגים טכניקת מיקרו-הזרקה חסונה לביצוע מחקרי ביטוי-יתר של mRNA והשתקה גנטית באמצעות מורפו-אוליגו-נוקלאוטידים בדגי zebrafish. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את תפקידו של ה-Cilium במחלות כליות ציסטיות.

אם כן, בואו נתחיל. גישה עוצמתית אחת למחקרי תפקוד גנים היא הזרקה מיקרוסקופית של RNA עם כיסוי (capped RNA) שתומלל במבחנה (in vitro) לעוברי דגי זהב. בהדגמה זו, נבצע הזרקה מיקרוסקופית של תמליל המסומן ב-EGFP ונשתמש בביטוי GFP בעוברי שלמים חיים כקריאה נראית לעין להזרקה מוצלחת.

ראשית, נבצע תגובת תמלול in vitro של RNA עם כיפה (cap) עבור התמליל הרצוי. במעבדה שלנו, אנו מחדירים באופן שגרתי cDNA רצוי לתוך וקטור pCS2+, ומבצעים תגובת סינתזה in vitro של כמויות גדולות של RNA עם כיפה באמצעות ערכת Mmessage mMachine SP6. לאחר מכן, נטהר את דגימת ה-RNA על ידי הרצה בערכת RNeasy Mini או באמצעות מיצוי פנול-כלורופורם והשקעה באיזופרופנול.

קבעו בקפידה את ריכוז תכשיר ה-RNA ואחסנו אותו בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד למועד השימוש ביום ההזרקה. הפשיתו את דגימת ה-RNA, ערבבו קלות ב-vortex וסובבו בקיצור בנצנטריפוגה (spin down). כעת הכינו תמיסת עבודה עם מים סטריליים בריכוז סופי של 0.025% עד 0.05% phenol red; ה-phenol red משמש כסמן נראה להזרקת התמיסה אל העובר.

כאן נכין תמיסת עבודה של 100 nanograms per microliter של EGFP mRNA עם 0.05% phenol red. לבסוף, יש לשמור את דגימת העבודה על קרח ולהחזיר את מלאי ה-RNA למינוס 80 degrees Celsius. יש לעבור להכנת ה-morpho כאשר הדגימה תהיה מוכנה להזרקה.

אוליגוניוקלאוטידים אנטי-סנס מסוג מורפינו משמשים באופן נרחב לשינוי ביטוי גנים על ידי חסימת התרגום של חלבון מטרה או על ידי שינוי שחור של pre-mRNA. מורפלינו המשפיעים על שחור RNA בדגי zebrafish משמשים ככלי רב עוצמה לגנטיקה הפוכה באמצעות השתקת תפקוד גני. כאן נבצע הזרקה מיקרוסקופית של מורפו-אוליגו המכוון לאתר תחילת התרגום של pkd2. אנו משתמשים באופן שגרתי ב-300 M של מורפו-אוליגו, שתוכנן במיוחד עבור הגן הרלוונטי ונרכש מ-Gene Tools LLC.

לאחר מכן נוסיף 100 µL מים סטריליים כדי להכין תמיסת מלאי בריכוז 3 mM, ולאחר מכן נחלק את התמיסה לאליקוטים ונשמור אותם בטמפרטורה של 20°C- עד ליום ההזרקה. נחמם את תמיסת ה-morino בטמפרטורה של 65°C למשך חמש דקות. לאחר מכן נקרר את התמיסה באופן מהיר על קרח ונבצע ספינט קצר; שלב זה דנטוריрует מבנים שניוניים באוליגו ומבטיח שהתמיסה מומסת לחלוטין.

בשלב הבא, נכין תמיסת עבודה על ידי דילול תמיסת ה-Morpho במים סטריליים ובריכוז סופי של 0.025 עד 0.05% phenol red. בהדגמה זו, נכין תמיסת עבודה של 0.5 millimolar PKD two morino עם 0.05% phenol red. יש לשמור את תמיסת העבודה בטמפרטורת החדר ולגשת למילוי המיקרופיפט כאשר תהיו מוכנים להזרקת הדגימה זו.

כדי להתחיל, נצטרך להכין מיקרו-פיפטות שישמשו להזרקות. הדבר נעשה על ידי חימום ומתיחה של צינורות נימיים מזכוכית סיליקט BOS במכשיר מתיחה של מיקרו-פיפטות. לאחר מתיחת המחטים, הן נשמרות בצלחת פטרי על גבי כמות קטנה של חימר או סרט דביק.

בשלב הבא, נכין פלטות עבור תא מיקרו-הזרקה על ידי מזיגת agarose בריכוז 1.5% לתוך שלוש פלטות מדיום מסוג XE המעוצבות עם תעלות בצורת טריז. הדבר ישמש כשיטה פשוטה להחזקת העוברים במהלך ההזרקה. לאחר מכן, נותיר את פלטות תא ה-agarose להתמצק ונאחסן אותן בטמפרטורה של 4°C עד למועד השימוש בהן.

כדי להתחיל במילוי המיקרו-פיפט, חתכו את הקצה הדיסטלי באמצעות פינצטה או להב תספורת כירורגי כדי ליצור פתח הגלוי בקושי תחת מיקרוסקופ דיסקציה בהגדלה של 50x. לאחר מכן, הניחו שני µL מתמיסת העבודה שלכם.

הנח טיפה על לבישת כיסוי, חבר את החלק האחורי של מיקרופיפט למזרק של 5 mL המצויד בצינורית על מחט תת-עורית, וטבול קלות את הקצה הדיסטלי של המיקרופיפט בתוך טיפת תמיסת העבודה. הקפד לא לשבור את קצה המיקרופיפט. שאב את תמיסת העבודה דרך הקצה הדיסטלי של המיקרופיפט על ידי משיכת בוכנת המזרק.

בשלב הבא, נבצע כיול לנפח ההזרקה של המיקרופיפט. הניחו טיפה של שמן מינרלי על סלייד מיקרומטרי והפעילו את אספקת החשמל והאוויר למכשיר המיקרו-מזרק בעל דחפי לחץ (pressure pulse micro injector). לאחר מכן, חברו את המיקרופיפט למחזיק המיקרופיפטים של מכשיר המיקרו-מזרק.

המיקרו-מזרק מופעל באמצעות בקרת לחץ וההזרקות מופעלות על ידי לחיצה על דוושת הרגל מתחת למיקרוסקופ הדיסקציה. בדקו את נפח ההזרקה באמצעות המיקרו-מזרק על ידי הנחת טיפה מהתמיסה העובדת שלכם על שמן המיקרומטר. מדדו את קוטרה של הטיפה בעודה צפה כספירה על גבי השמן.

כוון את משך הזמן ואת לחץ ההזרקה כדי לכייל במדויק את נפח ההזרקה. שלב זה מסייע בהשחזרות של ניסוי המיקרו-הזרקה. בהדגמה זו, כל המיקרו-הזרקות יבוצעו עם קוטר טיפה של 0.15 millimeters.

לבסוף, לאחר כיולי נפח ההזרקה, השתמשו בכפתור העצירה (hold knob) של המיקרו-מזרק כדי למנוע מילוי חוזר ודליפה מהמיקרו-פיפט. כעת הגיע הזמן להכין את עוברי דג הזברה. דגי זברה מזדווגים באופן אקראי בשעות הבוקר המוקדמות; כדי להתחיל בהכנה, אספו עוברי דג זברה בשלב התא הבודד והניחו אותם בתוכ medium XE3.

בעזרת פיפט העברה של 3 ml, סדרו את העוברים לאורך התעלות בצורת טריז בלוחיות תא המיקרו-הזרקה. הסירו את המדיום כך שהעוברים יהיו טבולים באופן רדוד ולא מוצפים. שלב זה מסייע בהשקעת העוברים לתחתית התעלות וכן בחדירת המיקרו-פיפט דרך הקוריון.

כעת נתחיל בהזרקות. ראשית, נמניפולה את העוברים באמצעות המיקרו-פיפטה כך שציטופלזמה של עובר בשלב תא אחד תהיה גלויה תחת מיקרוסקופ הדיסקציה. יש להיזהר לא לשבור את קצה המיקרו-פיפטה; חדרו דרך הכוריון ולאחר מכן דרך החלמון עם המיקרו-פיפטה כדי להזריק אל תוך העובר.

בהדגמה זו, נבצע תחילה מיקרו-הזרקה לחלמון ישירות מתחת לתא, ונאפשר לציטופלזמה ולדיפוזיה להחדיר את תמיסת העבודה אל תוך התא. זרימה זו נראית לעין הודות לפנול אדום (phenol red) שהתווסף לתמיסת העבודה. מכיוון שמדובר בעובר של תא בודד, ניתן לבצע את ההזרקה ביד חופשית או באמצעות מניפולטור.

נדגים גם הזרקה ישירה לציטופלזמה של התא. מיקרו-הזרקה ישירה לתא היא שיטה יציבה יותר, אך היא גוזלת זמן רב מכיוון שהיא דורשת התניית אוריינטציה נכונה של העובר וטכניקת מיקרו-הזרקה מדויקת. כיוון שקרומי התא עמידים יותר מקרומי החלמון, לעיתים קרובות מהיר יותר להחדיר את המיקרו-פיפט דרך החלמון כדי להגיע לתא.

הכוונת הציטופלזמה כך שהקטב החייתי יפנה לתחתית התעלה ועבודה בידיים יציבות עשויות לסייע בשיטת הזרקה זו. לאחר המיקרו-הזרקה, העבירו את העוברים לצלוחית פטרי עם תווך E three והדגירו אותם בטמפרטורה של 28.5 °C להתפתחות תקינה. במהלך השעות והימים הבאים של התפתחות העוברים, עקבו אחר העוברים כדי לזהות את הפנוטיפים המבוקשים.

כדי לוודא את הצלחת המיקרו-הזרקה, ננטר את ביטוי ה-GFP בעוברים המתפתחים החל משלב המגן (shield stage) באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה של עוברי שלמים in vivo; ביטוי הקונסטרוקט הוא החזק ביותר במהלך האירועים המוקדמים של ההתפתחות העוברית ולעיתים קרובות פוחת במהלך ההתפתחות. הדבר קורה ככל שה-capped RNA המוזרק מתפרק בהדרגה, ותלוי ביציבות החלבון המבטא. בהתבסס על תוצאות שפורסמו בעבר, אנו מצפים ש-PKD two morphine יחקה את העקמומיות של ציר הגוף הגבי, כפי שנמצא בדגי זהב מוטנטיים מסוג PKD two, ויציג ציסטות בכליות בערך שניים עד שלושה ימים לאחר ההפריה.

הדגמנו עבורכם טכניקת מיקרו-הזרקה חסונה לביצוע מחקרי ביטוי-יתר של mRNA והשתקה גנטית באמצעות מורפו-אוליגונוקלאוטידים בדגי zebrafish. בעת ביצוע פרוצדורה זו, זכרו שזהו שלב חשוב: הזרקו ביד יציבה. זהו כל השלב.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.