בנייה של מיקרוסקופ ברזולוציה גבוה עם יכולות קונבנציונליות והשמנה אופטיות הולוגרפי
22 באפריל 2013
המערכת המתוארת במסמך זה מעסיקה מלכודת אופטית מסורתית, כמו גם קו השמנה אופטי הולוגרפית עצמאי, מסוגלת ליצור מניפולציה ומלכודות רבות. זה מאפשר יצירת הסדרים גיאומטריים מורכבים של חלקיקים שבירה בעת גם מאפשרים מדידות בו זמנית במהירות גבוהה, ברזולוציה גבוהה של הפעילות של אנזימים ביולוגיים.
בהליך זה, קו לכידה אופטי קונבנציונאלי והולוגרפי מורכב ומיושר כדי להשיג זאת תחילה, מדוד את המיקומים של רכיבים אופטיים, ולאחר מכן הרכיב את הרכיבים בצורה מאובטחת במיקומם הנכון. לאחר מכן, יישר את האופטיקה כדי לאפשר השמנה. השלב האחרון הוא לחסום את קרן ה-TED מהמראה ההולוגרפית.
בסופו של דבר, המערכת המוגמרת מאפשרת לכידה הולוגרפית ורגילה בו זמנית. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו לכידה רגילה בלבד, הוא שהיא מאפשרת מיקום בו זמנית של אובייקטי שבירה מרובים בתלת מימד ומדידות מהירות של מניפולציה של אובייקטים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שעיצוב, פריסה ויישור יכולים להיות מאתגרים.
נקודת המוצא של סרטון זה היא ספסל אופטי עם המיקרוסקופ במקום ליצירת מלכודת אופטית ב-980 ננומטר. התחל עם אחת מדיודות הלייזר הזמינות באורך גל זה. השתמש בלייזר הטיית חזיר עם קיטוב, תוך שמירה על סיבים במצב יחיד בקוטר שדה מצב ידוע.
הסיב צריך להיות ארוך מספיק כדי לשמש כמסנן אופן, ויש לסיים אותו עם מחבר תעלת סיבים עם מחבר FCPC או מחבר F-C-A-P-C. יש לטפל בסיב האופטי במצב יחיד בזהירות, יש להימנע מפיתולים. אבטח את דיודת הלייזר והתושבת המאפשרת בקרת כוח וטמפרטורה.
יש להצמיד את התושבת ישירות לספסל האופטי כדי למקסם את גוף הקירור הפסיבי. לאחר מכן, התקן את מחבר הסיבים לאופטיקה של איסוף הקורה. ודא שיציאת הסיבים שנבחרה תואמת את קוטר שדה המצב של הדיודה.
סיבי צמה מחברים את מתאם האיסוף לשולחן האופטי במרחק מספיק מהמיקרוסקופ כדי לאפשר ניתוב אלומה, הרחבה ומיקום של רכיבים אחרים. ניתן להשתמש בצבעי מוט כדי לתקן את מרווח העדשות למיקום חזק הניתן לחזרה. כוונן את יציאת הסיבים כדי להבטיח בזבוז אלומה עקבי על פני מרחקים הדומים לנתיב האלומה הכולל למיקרוסקופ.
ישנן חמש מראות בנתיב של קרן הלייזר DDE. החל מהלייזר dde, ישנן שתי מראות לכוון את הפלט שלו לתוך בית המיקרוסקופ. הקרן צריכה גם לעבור דרך מראה דיכרואית, המאפשרת שידור ללא הפחתה של אלומת דיודת הלייזר ב-45 מעלות לזווית האירועים.
לבסוף, שתי מראות DIIC נוספות המעבירות אור נראה, אך משתקפות ליד אינפרא אדום ומעלה. נתב את הקרן לתוך המיקרוסקופ והחוצה ממנו. מרחב אינסוף אחד נמצא בתוך בית המיקרוסקופ כדי להתאים את המראות, להסיר את מטרת המיקרוסקופ.
השתמש במראות ובאינפרא אדום viewכרטיס כדי לנתב את הקרן דרך הצמצם ב-Objective Mounting stage. אם האלומה אינה במרכז, כוונן את המראות כדי לקבע את היישור כך שהקרן תהיה במרכז. בעת הרכבת עדשות, מערכת כלובים עלולה לגרום להרכבה נוקשה.
ניתן להשתמש בקליפרים כדי למדוד מראש מרחקים בין עדשות לאורך מוטות כלוב לפני ההתקנה. התקן באופן זמני מצביע לייזר אדום עם מתאם מותאם אישית במקום המטרה כך שהקרן שלו תהיה לאורך הציר האופטי של המיקרוסקופ. השתמש בקרן מצביע הלייזר הגלויה כדי למקם וליישר בערך את מרחיב האלומה של 980 ננומטר.
מערך זה משתמש בעדשות עם אורך מוקד של 60 מילימטרים ו-125 מילימטרים בסידור קירי כדי להכפיל בערך את מותני האלומה. לאחר מכן, התקן את עדשות ההיגוי של 980 ננומטר באמצעות קרן המצביע כמדריך כאן. לכל עדשה יש תושבת באורך מוקד של 60 מילימטר, העדשה הראשונה בנתיב האלומה על שלב X, Y, Z מדויק עם טווח תנועה של לפחות חצי אינץ' כדי לאפשר היגוי קרן.
כעת ניתן למקם את העדשה השנייה כך שתיווצר סידור קירי אחד לאחד עם העדשה הראשונה. עדשה זו חייבת להיות ממוקמת כך שתהיה מצומדת אופטית למישור המוקד האחורי של המטרה. כדי להכין את המלכודת ההולוגרפית, הרכיבו את הלייזר של 1064 ננומטר על פלטפורמה מוגבהת בערך בגובה הקרן של 980 ננומטר.
הנח צלחת חצי גל ומקטב מיד לאחר פלט הלייזר. כדי לאפשר התאמה ידנית של עוצמת הלייזר. התקן את מרחיב הקרן עבור לייזר זה כך שפסולת הקרן תורחב כך שתתאים לגודל האלכסוני של המראה ההולוגרפית.
אם מוגבל על ידי מקום, השתמש כאן בעדשות עם אורכי מוקד קטנים, 16 מילימטרים ו -175 מילימטרים. כעת השתמש בקרן מצביע הלייזר כדי למקם את אפנן האור המרחבי או SLM, שהוא חלק מהחבילה ההולוגרפית המסחרית המשמשת. בניסוי זה, יש למקם את מאפנן האור המרחבי כך שיהיה מצומד אופטית למישור המוקד האחורי של המטרה.
מקם אותו כך שלקרן מצביע הלייזר תהיה זווית האירועים המינימלית האפשרית, אך כך שההשתקפות שלה תנקה בבטחה את כל החומרה על השולחן האופטי. מקם מראה נוספת מול מרחיב קרן הלייזר של 1064 ננומטר כדי לכוון את האור שלו למאפנן האור המרחבי. ודא שנורית מצביע הלייזר פוגעת במרכז צמצם מרחיב האלומה.
לבסוף, התקן זוג עדשות טלסקופ בין מאפנן האור המרחבי למראה הדיכרואית. לעדשות אלו אורכי מוקד של 125 מילימטרים ו -200 מילימטרים. הסר את מצביע הלייזר, השאר את תושבת המתאם המותאמת אישית כדי לשמש כצמצם יישור מסלול.
התחל לבדוק את היישור באמצעות קרן 980 ננומטר בלבד. השתמש במציג כרטיס אינפרא אדום כדי ליישר את קרן ה-980 ננומטר כך שתעבור לאורך הציר המרכזי של הצמצם במתאם המותאם אישית. לאחר מכן השתמש בכרטיס האינפרא אדום כדי להבטיח שקרן ה-1064 ננומטר פוגעת באותן נקודות כמו הקרן של 980 ננומטר לאורך נתיב האלומה המשותף שלהם.
לאחר שזה נעשה, החלף את מתאם ההרכבה של מצביע הלייזר המותאם אישית בשמן צמצם מספרי גבוה או מטרת מים. לאחר מכן, יישר את מלכודת ה-980 ננומטר על ידי הליכה על קרן הלייזר עד שנראה דפוס הפרעה סימטרי רדיאלי במצלמה כשהמראה ההולוגרפית כבויה. יישר את מלכודת ה-1064 ננומטר על ידי שימוש במודולטור האור המרחבי ובמראה הדיכרואית הראשונה שתלך על אלומת ה-1064 ננומטר של האו"ם.
בדוגמה זו, התמונה המיושרת לשתי ההשמנות מציינת יישור טוב להשמנה יעילה, אך ניתן למקד אותה עוד יותר. ישנן גם סטיות קלות הקשורות לקרן 1064 העגולה, הפוגעת במראה SLM מרובעת, שלא ניתן לבטל בקלות על ידי חידוד יישור העדשה. על מנת לחסום את המלכודת המיוצרת על ידי האלומה הלא מופעלת ממודולטור האור המרחבי, הכנס אובייקט אטום קטן בנתיב האור הלא מופעל במיקום המצומד למישור הדגימה עבור מערכת זו.
מיקרוספירה אטומה בקוטר 100 עד 300 מיקרון, שהיא מתכת, מודבקת על כיסוי זכוכית עגול שקוף אינפרא אדום או חלון. הבלוק ממוקם בנקודת המוקד המשותפת של העדשות, המצומד אופטית למישור הדגימה. אם אלומות הלכידה האופטיות מוזרקות לחלל האינסופי של המיקרוסקופ, ניתן למקם את חוסם האלומה כדי לחסום אור לא מרוץ או להזיז אותו כדי לאפשר לכל האור לעבור.
המערך המורכב מאפשר למפעיל ללכוד מספר אובייקטים שבירים בזמן אמת ולמקם אותם בכל שלושת הממדים בשדה הראייה. כאן, היכולות ההולוגרפיות של המכשיר מוצגות על ידי לכידה של מיקרוספירות, תלויות במים נטולי יונים, עיגולים אדומים וירוקים מציגים מיקומי מלכודת כאשר ירוק מציין מלכודת שנבחרה למיקום מחדש בקליפ זה, ההשמעה מואצת לאחר לכידה של אובייקט. המלכודת שלו ממוקמת מחדש באופן ידני.
הסידור הסופי כולל 11 חרוזים המתארים את הלוגו של אוניברסיטת יוטה שבה בוצע ניסוי זה. המערכת מאפשרת גם שימוש במלכודות ההולוגרפיות והקונבנציונליות יחד. כאן שתי שורות של מלכודות הולוגרפיות מוגדרות ונשלטות על ידי המפעיל.
מלכודת קונבנציונלית נוספת מוגדרת בין שתי השורות. מיקרוספירה התלויה במים נטולי יונים קשורה על ידי המלכודות. החרוז המרכזי מועבר לתזוזה מרחבית מקסימלית של 4.1 מיקרומטר ולאחר מכן מחזיר אותו למיקומו המקורי באותן נסיבות.
אבל כשהחרוז המרכזי נע במהירות של 82 מיקרומטר לשנייה, נוצר רצף הפריימים הזה. שימו לב לטשטוש התנועה בתמונה השנייה והשלישית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לפרוס וליישר מערכת מלכודת אופטית כפולה עם מלכודת הולוגרפית עצמאית ומלכודת רגילה באותה הגדרה.
אל תשכח שעבודה עם לייזרים בעלי הספק גבוה עלולה להיות מסוכנת ביותר ולנקוט באמצעי זהירות כגון הרכבת משקפי מגן מתאימים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר מערכת המשלבת טכניקות של לכידה אופטית קונבנציונלית והולוגרפית, המאפשרת מניפולציה של מספר לוכדות. גישה חדשנית זו מקלה על יצירת סידורים גיאומטריים מורכבים של חלקיקים שבירים, תוך שהיא מאפשרת מדידות במהירות גבוהה וברזולוציה גבוהה של פעילות אנזימטית ביולוגית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- לכוד אופטי
- ביופיזיקה
- מדידת פעילות אנזימטית
רקע
- שיטות לכידה אופטית מסורתיות מוגבלות ביכולתן להפעיל מניפולציה על מספר עצמים בו-זמנית.
- לכידה אופטית הולוגרפית מציעה גמישות משופרת במיקום ובמניפולציה של חלקיקים.
- שילוב של טכניקות אלו יכול לשפר את דיוק המדידה ואת המהירות.
- משתמשים חדשים עשויים להתמודד עם אתגרים בתכנון וביישור של רכיבים אופטיים.
מטרת המחקר
- פיתוח מערכת המאפשרת לכידה אופטית קונבנציונלית והולוגרפית בו-זמנית.
- מתן אפשרות למניפולציה של מספר עצמים בעלי מקדם שבירה בשלושה ממדים.
- סבסוד ביצוע מדידות מהירות של פעילות אנזימים ביולוגית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הרכבה וכיול של רכיבי הלכוד האופטי.
- מדידת מיקומים עבור רכיבים אופטיים.
- קיבוע בטוח של רכיבים במיקומים הייעודיים.
- כיול האופטיקה כדי לאפשר לכידה יעילה.
תוצאות עיקריות
- המערכת משלבת בהצלחה טכניקות לכידה קונבנציונליות והולוגרפיות.
- היא מאפשרת מיקום סימולטני של מספר אובייקטים שוברי אור.
- הושגו מדידות במהירות גבוהה של פעילות אנזימטית.
- משתמשים דיווחו על קשיים בהגדרה הראשונית, אך הכירו ביתרונות המערכת.
מסקנות
- המערכת שפותחה משפרת את היכולות של טכניקות לכידה אופטית.
- היא מספקת יתרונות משמעותיים לחוקרים הבוחנים תהליכים ביולוגיים.
- ייתכן שנדרש אימון נוסף עבור משתמשים חדשים כדי לשלוט בהגדרת המערכת.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מערכות לכידה אופטית מאפשרות מניפולציה מדויקת של אובייקטים בעלי מקדם שבירה לצורך מדידות כוח ותנועה ברזולוציה גבוהה בסביבות ננומטרים ופיקוניוטונים. שילוב של לכידה קונבנציונלית והולוגרפית מאפשר מיקום סימולטני של מספר אובייקטים ובקרה תלת-ממדית בזמן אמת, דבר התומך במחקרים מכניסטיים של אינטראקציות מולקולריות ומכניקה תאית. יכולת זו מגבירה את הביטחון בחיזויים בעת תיקוף מטרות, על ידי כך שהיא מאפשרת הערכה כמותית של כוחות קישור ושינויים קונפורמציוניים בתנאים פיזיולוגיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות מדידה ישירה של כוחות קישור מולקולריים ודינמיקה של יצירת קומפלקסים.
- ערך תפעולי: מספק תיקוף פונקציונלי של מטרה על ידי מדידת כוחות בסדר גודל של piconewton הנוצרים על ידי מנועים מולקולריים או פעילות אנזימטית בזמן אמת.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח באמצעות הפקת נתונים כמותיים של כוח-העתקה המתואמים עם מעורבות המטרה ומנגנון הפעולה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לתהליכי עבודה המשכיים על ידי מתן אפשרות למניפולציה מבוקרת של חרוזי דיאלקטר או אברונים תאיים כחיישני כוח.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה של הבדיקה והדירות באמצעות מיקום מדויק וקריאה סימולטנית של מיקום המלכודת ביחס לתנועת האובייקט.
- יכולת הרחבה: תומך במוכנות לסריקה באמצעות יצירת תבניות הולוגרפיות למלכוד מקבילי של מספר אובייקטים בשדה הראייה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: שומרת על הרלוונטיות למחלה על ידי כך שהיא מאפשרת מדידה של תכונות מכניות בננו-סקלה בתאים ראשוניים או במודלים שמקורם ברקמה תחת תנאים קרובים לתנאים פיזיולוגיים.
- הסרת סיכונים מכיסטית: מקשרת בין תצפיות בשלב הגילוי לאישוש פרה-קליני באמצעות קריאות של ייצור כוח, המנחות אסטרטגיות למודולציה של המטרה.
- קידום מותאם סיכון: תומכת בהחלטות go/no-go על ידי כימות האופן שבו הפרעות משפיעות על הפלט המכני במערכות הרלוונטיות למחלה.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
המערכת משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות, דרך זיהוי מובילים (leads) ועד לתיקוף פרה-קליני, על ידי אספקת מדדים ביופיזיקליים כמותיים המנחים את תיעדוף המטרות ואת הבירור של המנגנון.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי מתן אפשרות למדידה ישירה של כוחות בין-מולקולריים ושינויים קונפורמציוניים בקומפלקסים של חלבונים.
- סינון (Screening): מספקת מוכנות למבחנים באמצעות מעקב בעל רזולוציה גבוהה ומהירות גבוהה אחר מיקום של עצמים לכודים, ובכך מקלה על הערכה אמינה של תרכובות באמצעות קריאות מבוססות כוח.
- אנליטיקה: מייצרת מדידות של העתקה (displacement) בקנה מידה ננומטרי ומדידות כוח בפיקוניוטונים, המאפשרות לצומי מחקר להשוות בין תנאים ולהעריך את יעילות המודולציה של המטרה.
- מחקר תרגומי: מקשרת לרציפות פרה-קלינית על ידי מתן אפשרות לפנוטיפ מכני במערכות תאיות הרלוונטיות למחלה, ובכך תומכת בהתאמת ביומרקרים למסלולי מכנו-טרנסדוקציה (mechanotransduction).
- שימוש חוזר ברמת הארגון: משמשת כפלטפורמה לשימוש חוזר לצורך ניתוח רב-פרמטרי לאורך פרויקטים שונים, ובכך מפחיתה הגדרות מערכת כפולות ומאפשרת סטנדרטיזציה של פרוטוקולי מדידת כוח בין צוותים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון תחזיתי באמצעות מדידה ישירה וללא סימון (label-free) של פלטים מכניים, המפחיתה עמימות בפירוש המנגנון של המטרה.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ויכולת הרחבה באמצעות תבניות לכידה הולוגרפיות ובקרה סימולטנית של מספר אובייקטים, מה שמשפר את התפוקה במערכי מדידת כוחות.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי אפשור הפחתת סיכונים מוקדמת של מטרות באמצעות נתוני כוח כמותיים, ובכך מפחית כשלים בשלבים מאוחרים עקב חסרונות מכניים בלתי צפויים.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע בתיעדוף מותאם סיכונים על ידי אספקת נתונים אובייקטיביים וכמותיים על חוזק המעורבות במטרה ודינמיקה קונפורמציונית על פני מולקולות מועמדות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות ביישור אופטי, בטיחות בלייזר ואופטימיזציה של נתיב הקרן עבור מערכות לכידה בעלות שני אורכי גל.
- תלוי בתשתית יציבה של שולחן אופטי, שלבי הזזה מדויקים ורכיבים תואמים לאינפרה-אדום לשילוב לייזרים של 980 nm ו-1064 nm.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי לכידה, נהלי כיול ותהליכי ניתוח נתונים לקריאות של כוח והעתקה.
- כולל שיקולי התאמה במעבר מבדיקות מבוססות חרוזיים לתאים ראשוניים או לנתחי רקמה, בשל מקדמי שבירה משתנים ומגבלות חיוניות של הדגימות.
- מוגבל על ידי מורכבות היישור ואבberations פוטנציאליות הנובעות מפרופילי קרן שאינם תואמים, במיוחד כאשר תבניות הולוגרפיות מקיימות אינטראקציה עם הגאומטריה של הש modulator של האור המרחבי.
