הדמיה סימולטנית רב-צבעונית של מבנים ביולוגיים עם מיקרוסקופ לוקליזציה של פוטו-אקטיבציה פלואורסצנטית

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמות מספר מיני חלבונים בו זמנית בדיוק ננומטרי בתאים קבועים או חיים. זה מושג על ידי התאמת מיקום המצלמה והאופטיקה עד להקרנת תמונה ממוקדת מהמיקרוסקופ על שבב המצלמה. השלב השני הוא סידור קרני לייזר כך שהן מיושרות ישירות על דגימה על במת המיקרוסקופ.

לאחר מכן, דגימת התא המוכנה מוארת ונבחר תא המבטא את החלבונים הרצויים. השלב האחרון הוא לדמות את התא במיקרוסקופ לוקליזציה של הפעלת פוטו פלואורסצנטי על ידי הארת הדגימה בלייזרים, ולאחר מכן הפניית הקרינה של התא לשבב המצלמה כדי לרכוש מערך נתונים. בסופו של דבר, מיקרוסקופ לוקליזציה של הפעלת צילום פלואורסצנטי משמש להצגת לוקליזציה של מיני חלבונים מרובים בקנה מידה מרחבי ננומטרי בתאים קבועים או חיים ובשדה רחב או בעת שימוש בקרינה של השתקפות פנימית כוללת כדי לבודד אזור דק של הדגימה.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון מיקרוסקופ קונפוקלי או אלקטרונים, הוא שניתן לדמות מספר חלבונים בו זמנית ברזולוציה ננומטרית בתאים קבועים או חיים. השלבים הבאים מתייחסים למערכת מספור כפי שמוצג כאן, שהיא סכמטית להגדרת F Om הצבעונית המסופקת כאיור אחד בפרוטוקול הטקסט הנלווה ליישור המיקרוסקופ התחל בהנחת סולם כיול או רדיקל על המיקרוסקופ stage עם מטרה של פי 10 במקום והמנורה מוגדרת לאור מועבר. מרכזו את האנכי במרכז שדה הראייה.

לאחר מכן, כוונן את המיקרוסקופ לתאורת קוקר על ידי סגירת צמצם השדה והסתכלות דרך העיניים על האנכי. אם הקצוות של צמצם השדה אינם ממוקדים, כוונן את גובה המעבה עד שגם צמצם השדה וגם האדום יהיו ממוקדים. לאחר מכן כוונן את המיקום הרוחבי של צמצם השדה עד שהוא מרוכז ביחס לשדה הראייה וסגור את צמצם השדה עד שרק הרשת המרכזית באדום מוארת.

בפעם הראשונה שרכיבים אלה מורכבים, התאם את אורכי הנתיב של כל ערוץ כך שיהיו שווים. כדי לבצע את הפרויקט הזה, האדום על שבב המצלמה מכוון את המראות שבע ותשע וסוגר את צמצם הזיהוי כדי למנוע חפיפה מרחבית בין שני הערוצים. לאחר מכן מקדו את תמונת הרדיקל בערוץ האור המוחזר ובדקו אם הוא נמצא גם בפוקוס בערוץ האור המועבר.

אם התמונה בערוץ האור המשודר אינה ממוקדת, תרגם את מראה תשע עד שהתמונה הרדיקלית תהיה ממוקדת בו זמנית בשני הערוצים. התחל ליישר את הלייזרים על ידי הסרת עדשה אחת מנתיב הלייזר וחסימת קרני ההפעלה והקריאה. לאחר מכן הנח כרטיס לבן צמוד למראה ארבע, פתח את תריס המיקרוסקופ והתמקד עד שהתמונה הקיצונית מקרינה על הכרטיס מול מראה ארבע.

לאחר מכן, בטל את חסימת קרן הקריאה והתאם את המראה הראשונה כדי למרכז את לייזר הקריאה על שערות הצלב של התמונה הרדיקלית במראה ארבע. לאחר המרכז, הקרינו את התמונה הרדיקלית על מראה חמש והתאימו את מראה ארבע עד שהקרן ממורכזת על שערות התמונה של מראה חמש. אלומת הקריאה צריכה להיות מרוכזת כעת הן ב-M ארבע והן ב-M חמש.

לאחר מכן חסום את קרן הקריאה על ידי סגירת התריס הראשון. לאחר מכן, השליכו את התמונה הרדיקלית על מראה שלוש. הסר את מרחיב הקרן מנתיב הלייזר ובטל את חסימת לייזר ההפעלה.

כעת כוונן את מראה שתיים כדי למרכז את אלומת ההפעלה על שערות הצלב של התמונה הרדיקלית במראה שלוש. לאחר המרכז, החלף את מרחיב האלומה בין מראות שתיים ושלוש והתאם את מיקום מרחיב האלומה עד שהקרן מרוכזת על שערות הצלב של התמונה הרדיקלית. במראה השלישית, השליכו את התמונה הרדיקלית על מראה חמש והתמקדו.

בעזרת כפתור המיקוד של המיקרוסקופ, כוונן את זווית המראה הדיכרואית מספר אחת עד שקרן ההפעלה מרוכזת בתמונה האדומה. לאחר מכן חסום את לייזר ההפעלה על ידי סגירת התריס השני ללא מטרה ותריס המיקרוסקופ פתוח. פתח את תריס הקריאה הראשון והקרן את הלייזר דרך הצמצם האחורי של המיקרוסקופ.

כוונן את המראה החמישית עד שהקרן יוצאת מהמיקרוסקופ, כך שהקרן יוצאת מהמיקרוסקופ אנכית עם העדשה הראשונה והמטרה בחזרה למקומה. הניחו דגימה המכילה 100 ברום מיקרו-מולרי B על הבמה כשלייזר ההפעלה חסום. הקרן את לייזר הקריאה דרך מטרה של פי 60 ולתוך הצבע.

עם רווח הכפלת האלקטרונים מושבת. שלח תמונה זו למצלמה. לאחר מכן, מקד את המטרה במדגם.

פתח את הצמצם רחב מספיק כדי לאפשר הדמיה של פרופיל האלומה המלאה. לאחר מכן תרגם את הצמצם לרוחב כך שמרכז פרופיל הקרן והצמצם יהיו קונצנטריים. באמצעות תוכנת המצלמה, בחר את אזור העניין כדי לאפשר את אזור קריאת המצלמה הקטן ביותר המקיף את שני הערוצים והקלט את הקואורדינטות הללו.

בשלב זה, הקלט תמונת מצב בודדת כדי לייצג את פרופיל אלומת הקריאה. לאחר מכן, חסום את לייזר הקריאה על ידי סגירת תריס אחד ופתיחת תריס שני. על מנת להתחיל למדוד את פרופיל אלומת ההפעלה הקרנת לייזר ההפעלה לדגימה, במידת הצורך, השתמש ברווח הכפלת אלקטרונים של פחות מ-100 והתאם את המראה הדיכרואית הראשונה עד שהקרן מרוכזת בכל שדה ראייה.

לאחר מכן הקלט תמונת מצב של פרופיל קרן ההפעלה על מנת להתחיל לרכוש תמונות כף יד F צבעוניות. בטל את כל תאורת החדר. לאחר מכן הקרן את מנורת הכספית דרך תושבת ההיפוך על תאים שעברו טרנספטציה ושנה את קוביית המסנן לכזו המכילה את אורך גל העירור המתאים של מתג הצילום המקדים. מצב.

לאחר בחירת תא, הזז את תושבת ההיפוך כלפי מטה על מנת לאפשר ללייזרים לעבור למיקרוסקופ, שנה את צריח המסנן לזה המכיל את המראה הדיכרואית המתאימה להדמיה כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן הקרינו את התמונה הזו למצלמה כדי להבחין בין תאים שעברו טרנספטציה לבין פלואורסצנטיות ברקע וכדי לאשר שהמולקולות ניתנות לצילום. האירו בקצרה את הדגימה בהספק נמוך של פחות מ-10 מיקרו וואט מלייזר ההפעלה.

לאחר מכן, הכינו את תוכנת המצלמה לרכישת סדרות קינטיות על ידי הגדרת משחק הכפלת האלקטרונים ל-200 ואת מספר הפריימים הרצוי בין חמש ל-10,000. הגדר גם את החשיפה בין 10 ל-30 אלפיות השנייה. לאחר מכן חסום את אלומת ההפעלה, בטל את חסימת אלומת הקריאה והקרין את תמונת התא המואר למצלמה.

בחר מישור מוקד ליד הממברנה התאית התחתונה על ידי הזזת המיקוד כלפי מטה עד שהמולקולות הבודדות אינן נראות עוד. לאחר מכן הזיזו את המוקד בהדרגה כלפי מעלה עד שהמולקולות נראות לראשונה. כעת שחררו את החסימה של אלומת ההפעלה והאירו את הדגימה בעוצמה של פחות מוואט אחד לסנטימטר רבוע.

התחל לרכוש נתונים אלה באמצעות תוכנת המצלמה תוך שמירה על צפיפות של 0.1 עד מולקולה אחת הניתנת לצילום למיקרון מרובע על ידי התאמה דינמית של מסנן הצפיפות הנייטרלית מול לייזר ההפעלה. לקבלת השתקפות פנימית כוללת, הדמיה פלואורסצנטית, תושבת מראה חמש ועדשה אחת על שלב תרגום יחיד להזזה לרוחב ממש מאחורי הכניסה למיקרוסקופ. כאשר מראה חמש ועדשה אחת מתורגמות, הלייזרים היוצאים מהמטרה כלפי מעלה דרך הדגימה יתהפכו בהדרגה לצד אחד, ימשיכו לתרגם את השלב עד שזווית הלייזרים תגיע ל-90 מעלות מהאנכי.

בשלב זה, הלייזר המתהווה עצמו ייעלם והלייזר הנכנס ישתקף בחזרה לתוך הצמצם הנע נגד מקביל לקרן הנכנסת ויוזז הצידה. אתה אמור לראות הפחתה ברקע כאשר הדגימה נכנסת לפלואורסצנציה של השתקפות פנימית כוללת עם השלמת רכישת התמונה, סגור מיד את תריס המיקרוסקופ וחסום את שתי הקרניים. השבת את רווח הכפלת האלקטרונים.

הגדר את המצלמה להקליט מסגרת אחת והגדר את אזור קריאת המצלמה לגודלו המרבי. לבסוף, חסום ערוץ אחד על ידי הנחת כרטיס מעל F שלוש או F ארבע עם מסנן מעבר ארוך המותקן על מנורת המיקרוסקופ. האירו את הדגימה והקרינו תמונה זו למצלמה.

הקלט תמונת מצב של התא כדי לייצג את התא כולו באור המועבר. מוצגת כאן דוגמה לרכישה של כף יד F בשני צבעים של NIH שלושה תאי T שלושה המבטאים גם DENDRA שני המגלוטינין וגם PAM Cherry actin. הערוץ המשודר משמאל מכיל אורכי גל ארוכים יותר מהערוץ המוחזר מימין.

מוצגות כאן תמונות מאותם שני צבעים של רכישת F OM לאחר רקע, חיסור וטרנספורמציה כדי לכסות את הערוץ השמאלי והימני. ניתן לזהות מולקולות בודדות ולמקם אותן. חלק מהמולקולות נראות בהירות יותר בערוץ המשודר ולחלקן יש פיזור פליטה אחיד יותר בין שני הערוצים.

זה מצביע על ההבדל בספקטרום הפליטה בין דובדבן PAM ו-DENDRA שניים בהתאמה ומשמש בניתוח לזיהוי שני המינים הללו. ההיסטוגרמה המוצגת כאן מציינת יחס של עוצמת הערוץ המועבר באדום חלקי העוצמה הכוללת עבור כל המולקולות המקומיות לאחר החלת סובלנות. הפיקסלים מופיעים לבנים בתמונה השמאלית התחתונה ואדומים בתמונה הממוזגת הסופית המוצגת בפינה הימנית התחתונה, בעוד שהפיקסלים באזור הירוק מוצגים כלבן בתמונה הימנית העליונה ומופיעים בירוק בתמונה הממוזגת הסופית המוצגת בפינה הימנית התחתונה.

רמות הסף שנבחרו בעת העיבוד משפיעות מאוד על מידת הרעש ומראה הקולוקליזציה. המוצג. להלן שלוש אפשרויות שונות לעיבוד שגורמות לדרגות שונות של דימום דרך רמות הסף השמרניות ביותר המוצגות בשתי התחתונות. היסטוגרמות אלפא של כף היד בצבע F הן הטובות ביותר לפירוש כשיש שתי פסגות שניתן להבחין בהן בתמונה.

בעוד שההיסטוגרמה משמאל היא מועמדת טובה לניתוח נוסף, התמונות המתקבלות משתי ההיסטוגרמות האחרות יהיו הרבה יותר קשות לפירוש בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות כמו השתקפות פנימית מלאה, מיקרוסקופיה והדמיית תאים חיים על מנת לענות על שאלות נוספות כמו כיצד חלבונים מאורגנים בקנה מידה ננומטרי בקרומי תאים חיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להגדיר מיקרוסקופ FAR משלך ולהשתמש בו כדי לרכוש נתונים.

אל תשכח שעבודה עם לייזרים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש להשלים הדרכת בטיחות לפני שתנסה הליך זה.