צבע רב לוקליזציה מיקרוסקופיה של חלבוני ממברנה בודדת ב- Organelles של תאים בתרבית של חיים

טכניקה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתהליכים רגולטוריים כגון איזה תפקיד ממלאים דינמיקה וארגון חלבונים בהסתגלות תפקודית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לעשות זאת בתאים חיים, ובכך לחשוף דינמיקה של חלבון ברמת המולקולה הבודדת. למרות ששיטה זו יושמה במקור כדי לספק תובנות לגבי הארגון המרחבי-זמני של חלבוני הממברנה המיטוכונדריאלית, ניתן ליישם אותה גם עבור אברונים אחרים וחלבוני ממברנה אחרים.

מי שידגים את הטכניקה יהיה טימו אפלהנס, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. לאחר העברה והכנת דגימות תאים והמיקרוסקופ לפי פרוטוקול הטקסט, הרכיב את הדגימה המוכנה עם חרוזים פלואורסצנטיים במחזיק הדגימה בין טבעת ה-PTFE לטבעת הגומי האדומה. הפעל את המיקרוסקופ, את כל רכיבי החומרה ואת כל התוכנה הדרושה למיקרוסקופיה.

השתמש ברקמה טרייה ונטולת מוך מרוססת באיזופרופנול כדי לנקות את עדשת האובייקט ואת החלק התחתון של החלקת הכיסוי. לאחר מכן הניחו טיפת שמן טבילה על האישון של עדשת האובייקטיב. לאחר מכן, הנח את מחזיק הדגימה עם דגימת החרוז על במת המיקרוסקופ כך שתחתית החלקת הכיסוי תיצור קשר עם השמן.

לאחר מכן התמקדו בחרוזים באמצעות אור שידור או קו לייזר. כוונן את העוצמה של שני לייזרי העירור כדי להשיג צפיפות אות דומה בשני ערוצי הקרינה. לאחר מכן חפש אזור עם אותות פלואורסצנטיים מובהקים רבים.

צור תצוגה ממוזגת של ערוצי הפלורסנט באמצעות תוכנת בקרת המצלמה. לאחר מכן השתמש בברגים במפצל התמונה כדי להטות ידנית את מפצל התמונה האופטי הפנימי כדי להשיג את שכבת העל הטובה ביותר של האותות משני ערוצי הפלורסנט. הפעל את תוכנת השליטה במיקרוסקופ TIRF ובחר להציג ערוצים בודדים במצב זרם חי.

צלם תמונת בזק, פלואורסצנטים מלהיבים בכל הערוצים. לאחר מכן השתמש בתמונה זו כדי לייצר את מטריצת הטרנספורמציה. הפעל את תוסף ניתוח התוכנה וטען את התמונות בצבע כפול שהוקלטו בעבר של חרוזי פלורסנט לתוכנה.

בחר את הכיוון המשמש של תעלות הפלורסנט. לחצו על Yes כשתתבקשו לכייל תמונות, ובחרו בתמונה שצולמה קודם לכן. פתח את מנהל היחידות כדי להגדיר מקדמי המרת יחידות, ולאחר מכן פתח את מנהל הלוקליזציה.

כדי לקבוע את פונקציית התפשטות הנקודה, או PSF, לחץ על הלחצן PSF Radius. בחלון PSF Estimator שנפתח, הגדר את הצמצם המספרי ואת מקסימום הפליטה. לאחר מכן לחץ על הערכת רדיוס PSF.

לאחר מכן, קבל את ה-PSF הניסיוני שהתקבל. הגדר את תיבת ההערכה, מספר לולאות הדפלציה וכמה ליבות המחשב משמשות לחישוב. לאחר מכן לחץ על לוקליזציה כדי להתחיל להתאים את התפלגות העוצמה של חלקיקים בודדים, באמצעות פונקציה גאוס סימטרית דו-ממדית.

פתח את מנהל הכיול. בתמונה המעובדת והממוזגת של שני הערוצים, יוצגו האות המקורי והמרכזים המקומיים. בחר במצב Affine.

לאחר מכן חבר ידנית את הזוגות המתאימים של מרכזים מקומיים בשני הערוצים, שמקורם באותו חרוז פלורסנט, על ידי ציור קו חיבור. חבר את האותות המתאימים המופצים על פני שדה הראייה. לאחר מכן לחץ על קבל ושמור את מטריצת הטרנספורמציה.

כדי לבצע הדמיה מולקולרית בודדת של חלבוני הממברנה המיטוכונדריאלית, התקן את החלקת כיסוי הדגימה בין טבעות הגומי ל-PTFE. לאחר מכן מלאו את החדר ב-0.5 עד 0.8 מיליליטר של מדיום הדמיה. נקה את עדשת האובייקט ואת החלק התחתון של החלקת הכיסוי.

לאחר מכן השתמש באור שידור או בקו לייזר כדי להתמקד בתאים, לאחר הוספת טיפת שמן לעדשה. לאחר מכן התאם את העוצמה של שני לייזרי העירור כדי להשיג עוצמה דומה, וחפש אזור עם אותות פלואורסצנטיים רבים. כוונן את זווית ההארה בתוכנת בקרת המיקרוסקופ TIRF כדי ליצור זווית תקרית קטנה יותר מהזווית הקריטית, או מאופן TIR, כדי לעורר את אזור העניין הספציפי באמצעות גיליון HILO.

התאמת התאורה של מיקרוסקופ TIRF כדי לעורר את אברוני התא באמצעות תאורת HILO דורשת שיפוט מהיר של יחס האות לרקע וניסיון במיקרוסקופ TIRF, כמו גם ידע במורפולוגיה של התא. הגדר את רווח ה-EM ובחר זמן חשיפה המתאים לניסוי שאוסף מספיק פוטונים למסגרת. לאחר מכן כוונן את עוצמת הלייזר על מנת להשיג יחס אות לרעש גבוה, שכן יחס זה תואם ישירות לדיוק הלוקליזציה.

מצא אזור בפריפריה של התא עם אותות מיטוכונדריה מוארכים שאינם חופפים ואותות של מולקולה בודדת. אם לא נראים אותות בודדים באחד הערוצים או בשניהם, המתן עד שההלבנה תגרום להופעת אותות של מולקולה בודדת. במקרה שצריך להלבין רק ערוץ אחד, כבה את הלייזר של הערוץ השני, כדי למנוע הלבנה, לפני הקלטת ערוץ זה.

הקלט עד שמספר האותות נמוך מדי להמשך סביר. הפעל את תוכנת עיבוד ההדמיה ובדוק אם יש מבנים מיטוכונדריאלים על ידי יצירת תמונת סכום מעובד מצטברת של לפחות 1,000 פריימים מוקלטים. הפעל את תוסף ניתוח התוכנה.

כדי לבצע עיבוד נתונים לצורך לוקליזציה ומעקב, טען את הנתונים הגולמיים. בדוק צבעוניות. בחר את הכיוון הנכון של שני הערוצים.

כאשר תתבקש לכייל תמונות, טען את מטריצת הטרנספורמציה. הערוצים יוצגו בנפרד. פתח את הנתונים הגולמיים מגורם המכיל של התמונה על-ידי לחיצה על הצג.

לאחר מכן פתח את מנהל היחידות בכרטיסייה העליונה והגדר מקדמי המרת יחידות בכל ערוץ. פתח את מנהל הלוקליזציה בכרטיסייה העליונה, והגדר את תיבת ההערכה ואת מספר לולאות הדפלציה. לחץ על PSF Radius כדי לפתוח את אומדן ה-PSF.

הגדר צמצם מספרי ומקסימום פליטה כדי לקבל את ערך ה-PSF התיאורטי. לחץ על קבל. חזור על פעולה זו עבור כל הערוצים.

לאחר מכן לחץ על לוקליזציה כדי להתחיל בלוקליזציה של חלקיק בודד עבור האותות המוקלטים בשני הערוצים. המתן עד שהתוכנה תסתיים. כעת, מתקבלת תמונה סופר-רזולורית עבור כל ערוץ במיכל התמונה של תוסף ניתוח התוכנה.

PINK1 הוא גורם חשוב המבטיח את תפקוד המיטוכונדריה. כדי לקבוע את הלוקליזציה של PINK1 ביחס ל-Tom20 במיטוכונדריה פונקציונלית ולא מתפקדת, נרשמה סדרת זמן של 1,000 פריימים. התמונה המצטברת של כל האותות לאורך זמן מערוץ אחד הראתה כי PINK1 היה ממוקם בציטוזול, בקרום החיצוני ובתוך המיטוכונדריה בתנאים רגילים, אך עדיף בקרום החיצוני של מיטוכונדריה דה-פולריזציה.

כפי שמראים התמונות המסכמות של חלקיקים מקומיים, PINK1 מופץ בעיקר בתוך מיטוכונדריה מקוטבת, בעוד ש-Tom20 ממוקם בקרום המיטוכונדריאלי החיצוני. זה מתבהר עוד יותר בתמונה הממוזגת של חלקיקי Tom20 ו-PINK1 מקומיים, מה שמראה שהתפלגות חלבון הממברנה החיצונית Tom20 רחבה בהרבה. כדי לאמת את הלוקליזציה של PINK1 בתוך המיטוכונדריה, תת-היחידה של 30 קילו-דלטון של קומפלקס הנשימה הראשון התמזגה ל-GFP הניתן לפוטו-אקטיבציה ותועדה על ידי מיקרוסקופ לוקליזציה של פוטו-אקטיביות פלואורסצנטית.

התמונה המשולשת המצטברת והתפלגות חתך הרוחב מציגות את שכבת העל של קומפלקס אחד ו-PINK1, המאשרת את הייבוא של PINK1 באורך מלא. נתונים אלה מדגימים כי תת-אוכלוסיות של PINK1 תופסות מספר מיקרו-תאים מיטוכונדריאליים. לאחר השליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 20 שעות, כולל הקלטה ועיבוד לאחר של נתונים, אם היא נעשית כראוי.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבדוק את תנועת האברונים. בעקבות הליך זה ניתן לקבוע את הלוקליזציה היחסית של חלבונים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המעקב אחר חלקיק בודד של חלבונים מיטוכונדריאלים להתבונן בהתנהגותם ב-Z2, ובתנאים מטבוליים שונים, ותחת לחץ.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע מיקרוסקופיה כפולה של חלבונים מיטוכונדריאלים כדי לחשוף את מיקומם התת-אברוני והסחר בהם.